Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo
14 de julho de 2010
Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da Aâ 1-42 Peptídeo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a preparação de sintéticos Aâ 1-42 Oligômeros, que prejudica a potenciação de longo prazo no hipocampo, um celular correlato de memória. Este procedimento é útil para investigar os mecanismos de Aâ induzida screening de patologia e de drogas.
O beta amiloide sintético 1-42 é ressuspenso em HFIP para primeiramente modernizar o peptídeo e posteriormente concentrá-lo até formar um filme para ligamentização. O filme é RESSUSPENSO em DMSO, diluído em tampão fosfato e incubado durante a noite. Por fim, o peptídeo oligomérico é diluído com tampão de registro e perfundido em fatias hipocampais agudas, onde a exposição efetiva ao beta amiloide sobre a plasticidade sináptica é avaliada.
Bem-vindos ao laboratório de Avio Orio na Universidade de Columbia, em Nova York. Olá, hoje vamos mostrar um procedimento que otimizamos para a preparação de todo o beta amiloide Li Rise, o qual é baseado em um protocolo originalmente proposto por Stein e colegas em 2003. Neste laboratório, utilizamos este procedimento para estudar a disfunção sináptica induzida pelo beta amiloide.
Então vamos começar. Deixe o frasco com o pó liofilizado de beta amiloide atingir a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar condensação quando for aberto sob a capela. Abra o frasco e adicione HFIP gelado para obter uma concentração final de beta amiloide de um milimolar.
Feche o vial e vortexe para misturar, utilizando uma seringa Hamilton para dividir rapidamente a solução igualmente entre três tubos de microcentrífuga de polipropileno de baixa ligação. Feche os tubos e incube por duas horas à temperatura ambiente para permitir que o peptídeo se misture. Abra os tubos e coloque-os em um speed vac para concentrar a solução. Centrifugue a 800 Gs sob vácuo por cerca de 15 minutos.
Certifique-se de que a temperatura não ultrapasse 25 graus Celsius para evitar a degradação da proteína. A centrifugação é finalizada quando um filme claro e seco de peptídeo for observado no fundo do tubo. O filme pode ser difícil de visualizar; feche os tubos e armazene alíquotas não utilizadas a menos 80 graus Celsius por até seis meses na capela. Use DMSO para ressuspender o filme de peptídeo até uma concentração final de cinco milimolar. Sonique em banho-maria por 10 minutos.
Para garantir a suspensão completa do peptídeo, armazene alíquotas de 1,6 microlitro da solução de beta amiloide cinco milimolar a menos 20 graus Celsius. Cada alíquota deve ser descongelada apenas uma vez, no dia anterior ao experimento: descongele uma alíquota da solução de beta amiloide cinco milimolar e adicione 98,4 microlitros de tampão fosfato estéril para um volume final de 100 microlitros, vórtex por 30 segundos e incube a quatro graus Celsius por 12 horas. Para permitir o início da ligamentização, incube lisado hipocampal fresco por 90 minutos.
No tampão de gravação padrão, o eletrodo estimulante é colocado sobre os colaterais de Shafer e o eletrodo de gravação é posicionado na camada radiada. Uma vez que uma resposta tenha sido encontrada e a linha de base esteja estável por 10 minutos, dilua todo o ligante beta amiloide até 200 nanomolares. O beta amiloide se liga não especificamente ao vidro no tampão de gravação, portanto use plástico tanto quanto possível.
Perfunda a solução de beta amiloide sobre as fatias durante 20 minutos. Aplique sua estimulação preferida de X. Por exemplo, um estímulo em rajada teta imediatamente após o tetânico, seguido da retomada da perfusão com tampão de gravação normal.
Monitore a gravação por pelo menos duas horas após o tétano para confirmar a indução de PTL e observar os efeitos do tratamento com beta amiloide. Acabamos de mostrar como preparar o beta amiloide oligomérico um a 42 para induzir prejuízo da plasticidade sináptica em fatias de hipocampo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a secagem excessiva do filme peptídico pode levar a uma ligação incompleta.
É igualmente fundamental utilizar plásticos para soluções de beta amiloide para evitar ligação peptídica não específica. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para preparar oligômeros sintéticos de Aβ 1-42, que são conhecidos por prejudicar a Potenciação de Longa Duração no hipocampo, um mecanismo fundamental relacionado à memória. O procedimento é essencial para o estudo da patologia induzida por Aβ e para fins de triagem de fármacos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre Doença de Alzheimer
Antecedentes
- A Doença de Alzheimer é caracterizada por níveis elevados do peptídeo Aβ 1-42.
- Os oligômeros de Aβ 1-42 estão implicados na disfunção sináptica.
- A Potenciação de Longa Duração (LTP) é um correlato celular da memória.
- Compreender os efeitos de Aβ pode auxiliar no desenvolvimento de medicamentos.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para a síntese de oligômeros de Aβ 1-42.
- Investigar os mecanismos de comprometimento sináptico induzido por Aβ.
- Facilitar a triagem de fármacos para possíveis tratamentos da doença de Alzheimer.
Métodos Utilizados
- Ressuspendendo o beta amiloide sintético em HFIP.
- Concentração do peptídeo em um filme para ligamentização.
- Ressuspendendo em DMSO e incubação em tampão fosfato.
- Avaliação da exposição ao beta amiloide em fatias hipocampais agudas.
Resultados Principais
- Os oligômeros de Aβ 1-42 preparados prejudicam efetivamente a plasticidade sináptica.
- O protocolo permite resultados reprodutíveis no estudo da disfunção sináptica.
- Os achados contribuem para a compreensão do papel do Aβ na patologia de Alzheimer.
- Aplicações potenciais na triagem de fármacos para tratamentos de Alzheimer.
Conclusões
- O protocolo para a síntese de oligômeros de Aβ 1-42 é eficaz e confiável.
- Este estudo aprimora a compreensão do impacto do Aβ em processos relacionados à memória.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar opções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A disfunção da plasticidade sináptica no hipocampo induzida por β-amiloide oligomérico1-42 fornece um modelo robusto e relevante para a pesquisa do estágio inicial da doença de Alzheimer. Esse paradigma permite a redução de riscos mecanicistas e confiança preditiva na validação de alvos e na triagem de compostos para disfunção sináptica. A abordagem auxilia na triagem de portfólios ao esclarecer a relevância translacional de intervenções candidatas direcionadas à patologia induzida por amiloide.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da disfunção sináptica induzida por amiloides em um sistema controlado ex vivo.
- Apóia a validação funcional de alvos ao quantificar a alteração da potenciação de longa duração após exposição ao β-amiloide oligomérico.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas em hipóteses sobre a doença de Alzheimer ao nível sináptico.
- Oferece uma plataforma para avaliação preditiva com confiabilidade na análise de compostos em estágios iniciais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um ensaio reprodutível para quantificar a disfunção da plasticidade sináptica em fatias hipocampais.
- Padroniza o preparo e a aplicação de β-amiloides oligoméricos para obter resultados consistentes no ensaio.
- Permite a avaliação confiável de compostos candidatos quanto à sua capacidade de atenuar a disrupção da PTL.
- Oferece suporte à escalabilidade e reutilização da plataforma para iniciativas de triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com mecanismos relevantes à doença implicados na patologia inicial de Alzheimer.
- Proporciona continuidade do engajamento do alvo molecular até os desfechos sinápticos funcionais.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco, vinculando os efeitos do composto a biomarcadores translacionais de saúde sináptica.
- Apoia a seleção e validação de modelos pré-clínicos para estudos in vivo subsequentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método conecta a descoberta inicial e a validação pré-clínica ao permitir testes de hipóteses, redução de riscos do alvo e avaliação quantitativa da função sináptica em resposta à exposição ao amiloide.
- Biologia de Descoberta: Facilita o teste da hipótese nula de comprometimento sináptico induzido por amiloides e a elucidação de vias.
- Triagem: Fornece um ensaio padronizado e reprodutível para avaliação de compostos frente à interrupção da PTL.
- Análise: Fornece leituras quantitativas da plasticidade sináptica para comparação estatística robusta entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados ex vivo a biomarcadores relevantes para a doença e pontos finais pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Oferece um fluxo de trabalho reutilizável para campanhas contínuas de validação de alvos e triagem em portfólios de neurodegeneração.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos para Alzheimer.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios de comprometimento sináptico.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao focar em desfechos funcionais relevantes para a doença.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco dos ativos em neurodegeneração.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de peptídeos, preparação de fatias hipocampais e registros eletrofisiológicos.
- Exige acesso a instrumentação especializada para medição de PTL e sistemas de perfusão controlados.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes nos procedimentos de preparação de peptídeos e nos protocolos de ensaio.
- Pode exigir adaptação para diferentes sistemas modelo ou classes de compostos com base na solubilidade e nas propriedades de ligação.
- As limitações práticas incluem a variabilidade na agregação de peptídeos e a sensibilidade às condições experimentais.
