Name: Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprenda a preparar oligômeros de β-amilóide 1-42 para estudar a disfunção sináptica em fatias de hipocampo. Este protocolo permite investigar mecanismos relacionados à doença de Alzheimer e triagem de fármacos.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS049442).&gt;

Ressuspensão peptídeo β-amilóide Antes de começar tenho pronto: <ul><li> Aâ 1-42 (pó liofilizado) </li><li> 1,1,1,3,3,3 Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) </li><li> Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml) </li><li> Estanques Hamilton seringa com Teflon parar de mergulhar (250 mL) </li><li> Dimetilsulfóxido (DMSO) </li></ul><ol><li> Permitir Aâ liofilizado 1-42 para equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a condensação ao abrir o frasco peptídeo. </li><li> Sob o exaustor, re-suspender Aâ peptídeo 1-42 em HFIP gelada para obter uma solução 1 mM e vortex a solução por alguns segundos. </li><li> Usando um vidro herméticos seringa Hamilton com plug Teflon, dividem-se rapidamente a solução 1-42 / HFIP Aâ igualmente em três frascos de polipropileno e selar os frascos. </li><li> Os frascos são então incubadas por 2 horas para permitir monomerization Aâ. Em seguida, abra os frascos e concentrar a solução Aâ 1-42 HFIP / sob vácuo, usando uma centrífuga SpeedVac (800 g, temperatura ambiente) até um filme peptídeo claro é observado no fundo dos frascos. Verifique cuidadosamente a temperatura no interior da centrífuga SpeedVac para evitar a degradação de peptídeos (max 25 ° C). </li><li> Vedação dos frascos e armazenar as alíquotas a -80 ° C. Aâ filme pode ser armazenado por seis meses. </li><li> Re-suspender um filme de adição de DMSO para obter uma concentração de até 5 mM Aâ 1-42. Sonicado em banho-maria por 10 minutos para garantir a completa re-suspensão. </li><li> Alíquota deste Aâ 5mM 1-42 solução em frascos de polipropileno. Seal todos os frascos e armazená-los a -20 ° C. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez. Cuidado com a condensação de água dentro do freezer. Peptídeos em solução degradam muito facilmente. </li></ol> Oligomerização Antes de começar tenho pronto: <ul><li> Aâ 1-42 / DMSO (5mm) </li><li> Tampão fosfato estéril </li><li> Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml) </li><li> Baixa ligação de polipropileno tubos de centrífuga (50 ml) </li></ul><ol><li> Diluir o Aâ obtidos 5mM 1-42 / DMSO alíquota com tampão fosfato estéril (até 100 l). </li><li> Vortex por 30 segundos e, em seguida, incubar por 12 horas a 4 ° C </li></ol> Tratamento fatia hipocampal Ao tratar fatias do hipocampo, que é importante para evitar a não-adesão específica peptídeo em provetas, tubos de superfícies de perfusão, ea câmara de gravação. Use preferencialmente de baixa ligação tubos de polipropileno e contêineres. Evitar o uso de objectos de vidro ou de plástico genérico-ware. Media de perfusão deve ser soro-albumina ou livre. Perfusão Aâ Antes de começar tenho pronto: <ul><li> Oligomerized Aâ 1-42 </li><li> Buffer de gravação (em mM: NaCl 124, KCl 4,4, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, e 10 de glicose) </li><li> Gravação eletrofisiológicas set-up com câmara de interface </li><li> Transversal fatias do hipocampo incubadas em tampão de gravação oxigenado durante pelo menos 90 minutos após a dissecção (T = 29 ° C; taxa de perfusão constante = 2 ml / minuto) </li></ul><ol><li> Imediatamente antes do experimento, diluir o Aâ oligomerized 1-42 alíquota para a concentração de trabalho adequadas (200 nM ou superior) em um tubo de polipropileno com pré-oxigenado buffer de gravação. </li><li> Perfundir a solução 1-42 Aâ por 20 minutos para as fatias antes da indução da plasticidade sináptica. </li></ol> Indução de plasticidade e follow-up <ol><li> Normalmente, o modelo mais amplamente utilizado da plasticidade sináptica é a LTP. Ela pode ser induzida através da estimulação tetânica de uma sinapse dada no hipocampo. Registramos respostas campo de sinapses entre projeções do Shaffer garantia e CA1 neurônios piramidais no radiatum estrato. Nosso estimulação tetânica consiste em um estímulo explosão teta que inclui três trens separados por intervalos de 15 segundos. Cada trem é composto de 10 rajadas de 5 Hz, onde cada explosão acarreta 5 pulsos de 100 Hz. Aplicar a estimulação tetânica imediatamente após a perfusão de Aâ oligomerized foi concluída. </li><li> Imediatamente após a estimulação tetânica voltar para perfusão com tampão de gravação normal. Manter uma taxa de perfusão constante, temperatura da câmara de gravação e oxigenação adequada durante toda a duração do experimento. </li></ol> Resultados representante e possíveis problemas O Aâ oligomerized acordo com o protocolo clássico de Stine et coll. 1, gera monômeros Aâ e uma variedade de oligômeros de diferentes tamanhoss (dímero, trímero, etc) A perfusão de oligomerized Aâ 1-42 leva à LTP diminuiu em Aâ tratados com fatias comparação com fatias controle. Nas nossas condições experimentais, onde 3-5 meses de idade camundongos C57BL/6J machos são usados, LTP em 200 nM Aâ tratados com fatias está em 150% média dos valores de referência, duas horas após a estimulação tetânica, enquanto em fatias controle de valores LTP são em% média de 200-250 baseline2. Em alguns casos, o tratamento com Aâ pode falhar para reduzir LTP hipocampal. Vários erros críticos que podem ocorrer incluem filme de secagem excessiva durante a concentração Aâ e oligomerização incompleta. Perfusão Aâ em fatias do hipocampo pode ser outra fonte de preocupação por causa das propriedades físico-químicas do peptídeo Aâ em solução, que está propenso a não-específica de adesão aos plásticos. Solução de problemas destas questões é discutido abaixo.

<ol><li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).</li>
<li>Vitolo, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+-peptide+inhibition+of+the+PKA%2FCREB+pathway+and+long-term+potentiation%3A+reversibility+by+drugs+that+enhance+cAMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).</li>
<li>Puzzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).</li>
<li>Lewczuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52, 332-334 (2006).</li>
<li>Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).</li>
<li>Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+of+LTP+in+rat+hippocampus+in+vivo+by+beta-amyloid+precursor+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments.</a> Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).</li>
<li>Itoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices+of+beta-amyloid-infused+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats.</a> Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).</li>
<li>Walsh, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+secreted+oligomers+of+amyloid+beta+protein+potently+inhibit+hippocampal+long-term+potentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.</a> Nature. 416, 535-539 (2002).</li>
<li>Lambert, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).</li>
<li>Gong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+hydrolase+Uch-L1+rescues+beta-amyloid-induced+decreases+in+synaptic+function+and+contextual+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.</a> Cell. 126, 775-788 (2006).</li>
<li>Trinchese, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calpains+improves+memory+and+synaptic+transmission+in+a+mouse+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease.</a> J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Columbia IACUC.

Como descrito acima, vários problemas na preparação de Aâ oligomérica pode resultar em LTP intacta. Uma maneira de avaliar se a degradação Aâ ou a falta de oligomerização Aâ pode ter ocorrido é o de avaliar a preparação Aâ usando TRIS-tricine PAGE / análise de Western Blotting e ultracentrifugação analítica (não descritos neste protocolo). Quando ocidental Blotting amostras são preparadas em condições non-denaturing/non-reducing, uma preparação bem sucedida deve gerar uma assinatura Western Blotting com bandas correspon...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946; 1-42 (liofilizado)</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>52517</td><td></td></tr><tr><td>Dissulfóxido de dimetila (DMSO)</td><td>Biotium, Inc.</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de polipropileno de 50 mL</td><td>Corning</td><td>05-538-67</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos MaxyClear de 1,5 ml com recuperação máxima</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Seringas GASTIGHT de 250 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>1725</td><td></td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>Branson</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>Sistema concentrador Savant SpeedVac</td><td>Vários</td><td>SC 110A</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de oligoméricas β-amilóide 1-42 indução e de impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Comprometimento de conexões sinápticas é provável que fundamentam as mudanças sutis que ocorrem amnésico nas fases iniciais da doença de Alzheimer s (AD). β-amilóide (Aâ), um peptídeo produzido em quantidades elevadas em AD, é conhecido por reduzir a potenciação de longa duração (LTP), um celular correlato de aprendizagem e memória. De fato, LTP deficiência causada por Aâ é um paradigma útil para o estudo experimental disfunções sinápticas em modelos AD e para triagem de drogas capazes de atenuar ou reverter tais deficiências sináptica. Estudos têm demonstrado que Aâ produz o rompimento LTP preferencialmente via sua forma oligomérica. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para LTP prejudicando por perfusão de oligomerized sintéticos Aβ1-42 peptídeo em aguda fatias do hipocampo. Neste vídeo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para a preparação de Aâ oligomérica<sub&gt; 1-42</sub&gt;. Então, seguimos uma experiência individual na qual LTP é reduzida em fatias hipocampais expostas a Aâ oligomerized<sub&gt; 1-42</sub&gt; Em comparação com fatias em um experimento de controle, onde não Aâ<sub&gt; 1-42</subExposição&gt; tivesse ocorrido.

Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da Aâ<sub&gt; 1-42</sub&gt; Peptídeo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a preparação de sintéticos Aâ<sub&gt; 1-42</sub&gt; Oligômeros, que prejudica a potenciação de longo prazo no hipocampo, um celular correlato de memória. Este procedimento é útil para investigar os mecanismos de Aâ induzida screening de patologia e de drogas.

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

O comprometimento das conexões sinápticas provavelmente fundamenta as alterações amnésicas sutis que ocorrem nos estágios iniciais da doença de Alzheimer (DA). ...

O beta amiloide sintético 1-42 é ressuspenso em HFIP para primeiramente modernizar o peptídeo e posteriormente concentrá-lo até formar um filme para ligamentização. O filme é RESSUSPENSO em DMSO, diluído em tampão fosfato e incubado durante a noite. Por fim, o peptídeo oligomérico é diluído com tampão de registro e perfundido em fatias hipocampais agudas, onde a exposição efetiva ao beta amiloide sobre a plasticidade sináptica é avaliada.Bem-vindos ao laboratório de Avio Orio na Universidade de Columbia, em Nova York. Olá, hoje vamos mostrar um procedimento que otimizamos para a preparação de todo o beta amiloide Li Rise, o qual é baseado em um protocolo originalmente proposto por Stein e colegas em 2003. Neste laboratório, utilizamos este procedimento para estudar a disfunção sináptica induzida pelo beta amiloide.Então vamos começar. Deixe o frasco com o pó liofilizado de beta amiloide atingir a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar condensação quando for aberto sob a capela. Abra o frasco e adicione HFIP gelado para obter uma concentração final de beta amiloide de um milimolar.Feche o vial e vortexe para misturar, utilizando uma seringa Hamilton para dividir rapidamente a solução igualmente entre três tubos de microcentrífuga de polipropileno de baixa ligação. Feche os tubos e incube por duas horas à temperatura ambiente para permitir que o peptídeo se misture. Abra os tubos e coloque-os em um speed vac para concentrar a solução. Centrifugue a 800 Gs sob vácuo por cerca de 15 minutos.Certifique-se de que a temperatura não ultrapasse 25 graus Celsius para evitar a degradação da proteína. A centrifugação é finalizada quando um filme claro e seco de peptídeo for observado no fundo do tubo. O filme pode ser difícil de visualizar; feche os tubos e armazene alíquotas não utilizadas a menos 80 graus Celsius por até seis meses na capela. Use DMSO para ressuspender o filme de peptídeo até uma concentração final de cinco milimolar. Sonique em banho-maria por 10 minutos.Para garantir a suspensão completa do peptídeo, armazene alíquotas de 1,6 microlitro da solução de beta amiloide cinco milimolar a menos 20 graus Celsius. Cada alíquota deve ser descongelada apenas uma vez, no dia anterior ao experimento: descongele uma alíquota da solução de beta amiloide cinco milimolar e adicione 98,4 microlitros de tampão fosfato estéril para um volume final de 100 microlitros, vórtex por 30 segundos e incube a quatro graus Celsius por 12 horas. Para permitir o início da ligamentização, incube lisado hipocampal fresco por 90 minutos.No tampão de gravação padrão, o eletrodo estimulante é colocado sobre os colaterais de Shafer e o eletrodo de gravação é posicionado na camada radiada. Uma vez que uma resposta tenha sido encontrada e a linha de base esteja estável por 10 minutos, dilua todo o ligante beta amiloide até 200 nanomolares. O beta amiloide se liga não especificamente ao vidro no tampão de gravação, portanto use plástico tanto quanto possível.Perfunda a solução de beta amiloide sobre as fatias durante 20 minutos. Aplique sua estimulação preferida de X. Por exemplo, um estímulo em rajada teta imediatamente após o tetânico, seguido da retomada da perfusão com tampão de gravação normal.Monitore a gravação por pelo menos duas horas após o tétano para confirmar a indução de PTL e observar os efeitos do tratamento com beta amiloide. Acabamos de mostrar como preparar o beta amiloide oligomérico um a 42 para induzir prejuízo da plasticidade sináptica em fatias de hipocampo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a secagem excessiva do filme peptídico pode levar a uma ligação incompleta.É igualmente fundamental utilizar plásticos para soluções de beta amiloide para evitar ligação peptídica não específica. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Neuroscience

Neurociência

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