Name: Única unidade de In vivo Gravações do quiasma óptico de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a gravar potenciais de ação de células ganglionares da retina em ratos anestesiados usando eletrodos de vidro com ponta afiada. Esta técnica inovadora permite estudar a degeneração retinal in vivo com alta relação sinal-ruído.

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Agradecemos ao Dr. Dan Verde para a prestação de apoio técnico durante o desenvolvimento destas técnicas experimentais. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant R01-EY016849A e da Família Smith New Investigator Award.

Parte I: Fabricação de tungstênio-in Glass-Eletrodos <ol><li> Um anel de grafite é colocado em um copo cheio de uma solução concentrada de nitrato de sódio (0.71g/mL) e hidróxido de potássio (0.34g/mL) dissolvido em água 1, eo copo é colocado sob o braço de costura de uma máquina de costura modificado . </li><li> Fio de tungstênio (0,5 mm de diâmetro, comprimento 6cm) é gravado para o braço de costura para que ele seja parcialmente imerso (1-2cm) em solução. </li><li> 2V são aplicados em todo o fio de tungstênio, anexando uma liderança positiva para o braço de costura e uma liderança negativa para o anel de grafite. </li><li> A máquina de costura é ligado e se o fio de tungstênio é mergulhado repetidamente na solução a uma taxa de aproximadamente 4Hz para 2 min, o que eletroliticamente grava o metal a uma ponta afiada. </li><li> O fio gravado é colocado em um micromanipulador manual eo ponto alinhado sob a orientação microscópica (40x) com o eixo de uma pipeta de vidro (0,25 mm OD, 0,175 milímetros ID) puxado para uma ponta de 1 milímetro com um puxador de vidro. Para impedir o movimento durante a inserção do fio, o vidro está temporariamente preso ao estágio do microscópio com putty. </li><li> O arame é cuidadosamente avançado na extremidade unpulled do vidro, para baixo o eixo, e através da abertura 1 Hm Um pequeno pedaço de vidro é visto como quebrar a ponta no vídeo, indicando um ajuste apertado do tungstênio no vidro. O fio deve se estender em torno de 5-10mm além da ponta para as gravações de ratos de fibra óptica. </li><li> Cianoacrilato é aplicada ao final unpulled do vidro e após o endurecimento da impedância elétrica é medido, onde eletrodos 1MΩ geralmente funcionam melhor. </li></ol> Parte II: Setup estereotáxica e Gravações Train de Spike <ol><li> O sistema de exibição de estímulo é ilustrado no vídeo, junto com o aparelho estereotáxico e microdrive para o posicionamento e diminuindo o eletrodo no cérebro. </li><li> Para realizar gravações de trem da retina spike o rato é anestesiado e, mais tarde paralisado. Procedimentos-padrão (não ilustrado) são usados ​​para a inserção cirúrgica de uma cânula veia femoral para a entrega da droga e uma cânula (Y-tubo) traqueal para ventilação mecânica durante a paralisia. Os experimentos são terminal para o animal. </li><li> Após os procedimentos de preparação, o animal é colocado sobre o cobertor de aquecimento ea cabeça é fixada na posição estereotáxica, como definido pelo cérebro de rato atlas 2, com orelha e barras de dente. </li><li> A sonda retal é inserido, que controla a manta de aquecimento através de uma unidade de controle homeotérmicos que mantém a temperatura corporal a 37 ° C. </li><li> Agulha de metal são usados ​​como leva a medir a freqüência cardíaca e eletrocardiograma monitor. </li><li> A pele é aberto na parte superior do crânio e da interseção de placas de crânio (bregma) é exposto. Um quadro de trave de design personalizado é fixado no local, um círculo é marcado no crânio em torno begma através de um buraco na trave e no travessão está temporariamente removidos. </li><li> O sistema é calibrado estereotáxica, posicionando a agulha guia sobre bregma. Um buraco de 5 mm é no crânio perfurado no local marcado e osso é removida, expondo o cérebro. Um anel fina de massa é colocada em torno da abertura no crânio para formar uma vedação em torno do buraco na trave, que é reposto no lugar. </li><li> Se o animal tem estado em um avião estável de anestesia por algum tempo, é injetado com paralítico a fim de impedir os movimentos dos olhos durante a coleta de dados. Após a respiração pára o animal está sob ventilação mecânica. Um programa personalizado faixas parâmetros ventilatórios e fisiológicos durante todo o experimento e informa o pesquisador se a ação compensatória é necessário nenhum parâmetro deve ir para fora dos níveis normais. </li><li> A agulha guia é atrasaram com o eletrodo de tungstênio e baixou para o cérebro. Após a penetração do cérebro do buraco barra está cheia de agar (não mostrado), eo conjunto microdrive é preso à trave para a estabilidade mecânica. O eletrodo de tungstênio é então lentamente avançado (2μm/sec) a agulha guia até a ponta é de cerca de 8-9mm abaixo do crânio, onde o quiasma óptico está localizado. </li><li> Trens de Spike pertencentes a células ganglionares da retina são identificados por sua resposta a estímulos visuais. Após o isolamento de uma única fibra óptica do campo receptivo da célula registrado é mapeado no espaço visual e suas propriedades de resposta são caracterizados com grades à deriva ou outros padrões visuais de interesse. A estabilidade do sistema permite a única unidade de gravações de várias horas 3. </li></ol> Materiais Adulto ratos Brown-Norway (250-400g) foram comprados de um fornecedor comercial e alojados em um mercado regulamentado (12/12) ciclo claro / escuro. A anestesia foi induzida com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de ketamina e xilazina (70 e 2 mg / kg, respectivamente, Henry Schein Inc) e mantidos para a duração da experiment com uma infusão intravenosa de ketamina e xilazina (30 e 1 mg / kg / hr) misturado com dextrose, soro fisiológico, e trietiodeto galamina (40 mg / kg / hr, Fischer Inc) através de um cateter (0,13 milímetros OD, Small Parts Inc ) na veia femoral direita. Galamina está incluída na mistura para paralisar os movimentos dos olhos. A taxa de infusão da bomba (WPI Inc) foi ajustada conforme necessário para manter um avião estável de anestesia, avaliada pela freqüência cardíaca e variabilidade da pressão arterial. Depois de paralisia, o animal era ventilado mecanicamente (Harvard Apparatus, Modelo 683) através de uma cânula traqueal em 60-80 respirações / min (2cc volume), com a taxa ajustada conforme necessário para manter end-tidal CO 2 medido com uma linha de in- capnometer (Novametrix Inc, modelo 710Sp) a 30%. Temperatura corporal foi regulamentada através de um sistema homeotérmicos cobertor controle (Harvard Apparatus Inc). Temperatura corporal, end-tidal freqüência cardíaca CO 2, e pressão arterial foram continuamente monitorizadas durante todo o experimento por um programa LABVIEW. Estímulos visuais foram apresentados em um Sony Multiscan 17e monitor CRT (média de luminância de 30 cd / m 2) rodando a 100 Hz com uma resolução de 800x600 pixels. Aquisição de dados e saída do monitor foram controlados com software personalizado escrito em Matlab e LabView em conjunto com um processador de imagem de vídeo (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) e caixa de ferramentas Psicofísica 4. O animal viu a tela de estímulo (40,4 x 30,2 cm) a uma distância de 16,5 centímetros por meio de lentes de contato (Ocular Instruments Inc), e solução oftálmica foi aplicado periodicamente durante o experimento para manter os olhos úmidos. O campo visual acessível a estimulação foi maximizada por inverter a montagem do animal em um aparelho estereotáxico (Stoelting Co) 14 centímetros elevada acima da superfície de uma mesa flutuante (TMC Inc) e configuração do monitor em um trenó personalizados que se movia sobre a mesa, juntamente um arco ± 100 graus sobre o nariz. Isto proporcionou um campo de exibição repositionable que se estendeu de 60 graus acima e 35 graus abaixo do nível dos olhos e ± 42 graus lateralmente do centro de monitor. Electodes tungstênio foram fabricadas com fios obtidos a partir de pequenas peças Inc e vidro de borosilicato personalizado obtido a partir de Friedrich e Inc. Dimmock Um padrão micropippete extrator (Sutter Instruments, modelo P-97) foi usado para dar forma a ponta de vidro. O testador da impedância do eletrodo foi comprado de Bak-Electronics. Eletrodos foram avançadas com um microdrive sistema motorizado (Newport Inc, StepperMike). Electrocardiograma e sinais de nervo óptico foram amplificados e filtrados com um amplificador de alta impedância de entrada multieletrodo (FHC Inc, X-Cell 3x4). Batimentos cardíacos foram detectados com um discriminador janela (WPI Inc, modelo 121). Potenciais de ação do nervo foram detectados e hora com resolução de 0,1 ms por um pico digitais discriminador (FHC Inc, APM). O discriminador pico foi fechado por um sinal de disparo do processador de imagem de vídeo para que os tempos estavam trancadas pico ao estímulo.

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Universidade de Boston.

Gravações de fibra óptica são uma abordagem atrativa para abordar questões experimental sobre a codificação e transmissão de informação da retina que requerem um olho intacto. Além disso, as propriedades de sinalização de ambos os olhos pode ser estudada em praticamente no mesmo estado fisiológico se o eletrodo está posicionado no quiasma óptico e das vias onde a atividade de cruzadas e descruzadas fibras do nervo óptico pode ser gravado com um único eletrodo de penetração. Gravações de fibra óptica são comuns em gatos,...

Única unidade de in vivo gravações do quiasma óptico de rato

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Informações sobre o mundo visual é transmitida para o cérebro em seqüências de potenciais de ação em axônios de células ganglionares da retina que compõem o nervo óptico.<em&gt; In vivo</em&gt; Gravações de trens de células ganglionares da espiga em diversos modelos animais revelaram muito do que se sabe sobre como o início dos processos do sistema visual e codifica a informação visual. No entanto, essas gravações, têm sido raros em um dos modelos animais mais comuns, o rato, possivelmente devido à dificuldade em detectar picos disparados por axônios de pequeno diâmetro. Os muitos modelos de doenças da retina envolvendo ratos motivar a necessidade de caracterizar as propriedades funcionais de células ganglionares, sem perturbar o olho, como com intra-ocular ou<em&gt; In vitro</em&gt; Gravações. Aqui, nós demonstramos um método para a gravação de células ganglionares trens pico do quiasma óptico do rato anestesiado. Primeiro mostramos como fabricar tungstênio em vidro eletrodos que pode pegar a partir de atividade elétrica dos axônios gânglio única célula de rato. Os eletrodos superar todos os comerciais que temos tentado. Em seguida, ilustrar o nosso sistema de design personalizado para estereotáxica<em&gt; In vivo</em&gt; Experimentos visuais neurofisiologia e nossos procedimentos para a preparação de animais e colocação de eletrodos fiável e estável no quiasma óptico.

Células ganglionares da retina transmitir informações visuais do olho para o cérebro com seqüências de potenciais de ação. Aqui, demonstramos como gravar os potenciais de ação das células ganglionares única<em&gt; In vivo</em&gt; De ratos anestesiados.

Única unidade de In vivo Gravações do quiasma óptico de rato

As informações sobre o mundo visual são transmitidas ao cérebro em sequências de potenciais de ação nos axônios das células ganglionares da retina que compõem o nervo óptico...

Vamos demonstrar hoje um sistema de gravação que desenvolvemos para registrar in vivo do quiasma óptico de rato. Esse tipo de gravação tem sido muito raro em ratos, em parte porque os axônios das células ganglionares da retina que compõem o nervo óptico são muito pequenos, dificultando o registro de células individuais, e como o rato é um modelo animal comum para degeneração retiniana, esse tipo de gravação tem o potencial de gerar muitas informações úteis. A chave para obter esses registros esteve nos eletrodos de vidro com ponta de tungstênio que projetamos, os quais possuem uma ponta longa e afiada que permite registrar potenciais de ação de axônios de pequeno diâmetro com alta relação sinal-ruído.Vamos guiá-lo pelo processo de fabricação desses eletrodos e mostraremos como montar o animal no aparelho estereotáxico; em seguida, apresentaremos um exemplo de gravação de trens de potenciais de ação provenientes de uma única célula ganglionar. São necessários três principais equipamentos para a fabricação dos eletrodos: um puxador de vidro padrão para produzir as micropipetas, uma máquina de costura utilizada para afiar o tungstênio e um microscópio padrão com objetiva de 40 x.Além disso, é necessário um anel de grafite com um polo fixo, que será colocado na solução concentrada de hidróxido de potássio e nitrato de sódio. Este é posicionado sob o braço da máquina de costura, e então um fino pedaço de fio de tungstênio é fixado com fita ao braço da máquina de costura, ficando parcialmente imerso na solução. Em seguida, são conectados cabos ao polo de grafite em uma extremidade e ao braço da máquina de costura na outra.Em outros dois volts será aplicada uma tensão através das pontas e a máquina de costura é ligada. Isso mergulha o dunston na solução e o afia eletromagneticamente por dois minutos. Uma vez que o tungstênio esteja afiado, ele é cuidadosamente removido do braço da máquina de costura, depois mergulhado em água para remover o excesso de solução e, em seguida, colocado sob o microscópio com objetivo de 40 x.A micropipeta de vidro possui uma abertura de pequeno diâmetro, com cerca de um a dois mícrons. O tungstênio afiado é então cuidadosamente inserido na extremidade traseira da micropipeta e empurrado com um micromanipulador mecânico. O tungstênio é avançado com muita cautela através da extremidade do vidro.É importante que haja um ajuste firme entre o tungstênio e o vidro, sendo comum empurrar o suficiente para que uma pequena quantidade de vidro realmente se quebre. Pode-se aplicar uma pequena quantidade de cola instantânea na extremidade traseira da micropipeta para fixar o tungstênio ao vidro. Agora que a fabricação do eletrodo está concluída, sua impedância é medida usando um teste de impedância com eletrodo metálico.Normalmente procuramos impedâncias próximas de um mega ohm. O eletrodo é então guardado em um estojo para segurança, pois é muito frágil. Os estímulos visuais são apresentados em um monitor colocado sobre uma plataforma móvel.Uma manta aquecida é usada para controlar a temperatura corporal do animal, e o sistema estereotáxico permite o movimento geral do microdrive, como mostrado aqui. A carcaça metálica na agulha guia hipodérmica e o eletrodo de registro atuam para reduzir os níveis de ruído. A agulha guia é inserida no cérebro e um microdrive é usado para abaixar lentamente o eletrodo através da agulha guia.Isso é ilustrado aqui, onde a carcaça metálica é posicionada sobre uma barra transversal que repousará sobre o crânio do animal. A agulha guia ficará projetada abaixo da barra transversal, conforme mostrado, e o contato elétrico entre a carcaça metálica e a barra transversal atua para reduzir os níveis de ruído. Em seguida, o animal é colocado sobre o cobertor aquecido.As barras auriculares são inseridas cuidadosamente. Neste momento, é importante garantir que a cabeça permaneça nivelada. Em seguida, insere-se uma barra dental para assegurar que a cabeça esteja fixa em todas as direções.Uma sonda retal é inserida usando vaselina. Isso medirá a temperatura corporal, que então será usada para controlar a temperatura do cobertor aquecido. A temperatura corporal deve permanecer entre 36 e 37 graus.Um único derivação de EKG é inserida na pele para monitorar a frequência cardíaca, que geralmente é de cerca de 300 batimentos por minuto. A frequência cardíaca é um bom indicador da profundidade anestésica. Os sinais vitais do animal são monitorados continuamente com software personalizado.Esses incluem pressão arterial, CO2, temperatura corporal e frequência cardíaca. Em seguida, a pele é removida da parte superior do crânio e o crânio é exposto. É importante limpar completamente o crânio para poder visualizar adequadamente os marcos cranianos utilizados para localizar o quiasma óptico.A montagem do travessão é então colocada no lugar. Isso é usado para delinear um círculo de cinco milímetros no crânio, que será então perfurado e removido. O orifício será perfurado ao redor do marcador no crânio bgma ilustrado aqui.O crânio exposto é mostrado com uma marca circular a lápis ao redor do bgma, que será perfurado antes do crânio ser broqueado. O sistema estereotáxico deve ser calibrado em relação ao torema, e isso é feito alinhando com precisão a agulha guia exatamente sobre o bgma e registrando a posição do estereotáxico. Após a perfuração, o crânio foi removido e o cérebro está exposto.Após a perfuração do crânio, o animal é paralisado e ventilado para evitar movimentos oculares. Isso é feito por meio de uma injeção intravenosa de gamine. A respiração é cuidadosamente monitorada; quando a respiração cessa, o tubo de ventilação é inserido no conector traqueal, momento em que o animal é submetido à respiração artificial.A agulha-guia é então abaixada no cérebro. O eletrodo de registro será introduzido através do gial até cerca de oito a dez milímetros abaixo do crânio, onde podem ser registrados potenciais de ação de células visuais no quiasma óptico. O eletrodo é lentamente introduzido no cérebro.Com o microdrive, uma célula visual pode ser ouvida disparando espontaneamente; escute a célula, observe sua resposta à presença de uma haste manual em seu campo receptivo. Em seguida, é apresentado um gradiente móvel, e, nesse momento, qualquer estímulo visual de interesse pode ser utilizado para estudar as propriedades de resposta das células ganglionares da retina usando a gravação no quiasma óptico.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Este vídeo demonstra a preparação de um modelo de rato para estudar a saúde da retina e a integridade das vias visuais. O potencial evocado visual e a referência de eletrorretinografia e os eletrodos ativos são conectados ao rato, seguidos pelo alinhamento da plataforma com o rato na frente da tigela de Ganzfeld para iluminação retiniana uniforme e fechamento da gaiola de Faraday para evitar interferência externa.

Preparando um modelo de rato para avaliar a integridade da via visual usando uma configuração de eletrofisiologia

Este vídeo demonstra o procedimento detalhado para preparar um rato anestesiado para registros eletrofisiológicos da atividade cerebral de vários locais. O couro cabeludo é dissecado para acessar o crânio e os orifícios são feitos em locais precisos para instalar e prender os eletrodos. Os eletrodos de microfios de tungstênio são então inseridos no local de destino para registrar os dados.

Registros eletrofisiológicos in vivo de atividades cerebrais de vários locais em ratos

Este vídeo demonstra o processo de medição de potenciais evocados visuais ou VEPs em um rato anestesiado e adaptado ao escuro com eletrodos cranianos pré-implantados, que registram os sinais elétricos do córtex visual do cérebro em resposta a estímulos luminosos.

Registro de potenciais evocados visuais através dos eletrodos do crânio em um modelo de rato

Este vídeo demonstra como registrar o eletrorretinograma (ERG) e o potencial evocado visual (VEP) em um rato consciente. O rato, com eletrodos implantados cirurgicamente, é primeiro adaptado ao escuro. Após a aplicação de gotas dilatadoras, o animal é colocado em uma contenção e posicionado em uma tigela Ganzfeld. Os sinais ERG e VEP são então registrados.

Registro do Eletrorretinograma e do Potencial Evocado Visual em um Rato

Ex vivo O ERG pode ser usado para registrar a atividade elétrica das células da retina diretamente de retinas intactas isoladas de animais ou humanos. Demonstramos aqui como os sistemas ERG in vivo comuns podem ser adaptados para gravações de ERG ex vivo, a fim de dissecar a atividade elétrica das células da retina.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

A desmielinização focal é induzida no nervo óptico usando microinjeção de lisolecitina. Os potenciais evocados visuais são registrados por meio de eletrodos cranianos implantados sobre o córtex visual para examinar a condução do sinal ao longo da via visual in vivo. Este protocolo detalha os procedimentos cirúrgicos subjacentes ao implante do eletrodo e à microinjeção do nervo óptico.

Visual Gravação Potencial Evocado em um modelo de rato de Experimental Nervo Óptico desmielinização

Este protocolo descreve a medição simultânea do eletrorretinograma e dos potenciais evocados visuais em ratos anestesiados.

Gravação simultânea de Eletrorretinografia e potenciais evocados visuais em ratos anestesiados

Mostramos procedimentos de implantação e de gravação cirúrgicos para medir sinais eletrofisiológicos visuais do olho (eletrorretinograma) eo cérebro (potencial evocado visual) em ratos conscientes, que é mais análogo à condição humana, onde as gravações são realizadas sem confunde anestesia.

Implantação e Gravação do Wireless Eletrorretinograma e Visual Potencial Evocado em ratos conscientes

Este protocolo descreve um método para obter gravações in vivo de neurônio único de alta densidade do tronco cerebral de camundongos com cabeça fixa. Essa abordagem é implantada para medir o potencial de ação disparado de neurônios no cinza periaquedutal ventrolateral - uma região do tronco encefálico inativa durante o sono REM (Rapid Eye Movement) - antes e durante a anestesia geral.

Gravações agudas de vários eletrodos de unidade única do tronco encefálico de camundongos com cabeça fixa

Este protocolo descreve uma técnica única usando uma abordagem transconjuntival para acessar o nervo óptico de rato para injeções.

Abordagem transconjuntival para injeção no nervo óptico de rato

Aprenda a gravar potenciais de ação de células ganglionares da retina em ratos anestesiados usando eletrodos de vidro com ponta afiada. Esta técnica inovadora permite estudar a degeneração retinal in vivo com alta relação sinal-ruído.

Única unidade de In vivo Gravações do quiasma óptico de rato

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