Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é fotoativar um agente sensível à luz específico, como um corante fluorescente quimicamente protegido, em um embrião de peixe-zebra vivo com resolução de uma única célula. Isso é conseguido pela injeção de um agente sensível à luz em embriões de um único estágio celular que expressam uma marca genética viva, permitindo localizar e direcionar com precisão quaisquer células de interesse. Como segundo passo, os embriões são cultivados e montados em ágar de ponto de fusão baixo, o que imobiliza o embrião vivo.

A seguir, utiliza-se microscopia de dois fótons para localizar uma referência transgênica fluorescente visível. O agente fotoativável é então ativado em um plano focal desejado e a extensão da fotoativação é monitorada. O destino das células marcadas resultantes pode então ser rastreado em estágios embrionários posteriores.

Este procedimento pode ser utilizado para a ativação de uma variedade de compostos com resolução de única célula em espécimes vivos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia confocal ou lâmpada de flash, é que permite a fotoativação de tecidos relativamente profundos em nível axial de algumas poucas micras com fototoxicidade relativamente baixa. Porém, o método apresentado aqui é usado para rastreamento de bordas selecionadas e pode ser aplicado para fotoativação de uma variedade de componentes, permitindo assim controle direcionado sobre processos de desenvolvimento e fisiológicos. Na noite anterior à injeção, prepare tanques de acasalamento separando machos e fêmeas de uma linhagem transgênica que expressa uma marca fluorescente visível.

Neste experimento, a linhagem transgênica expressa GFP sob o controle do promotor neurogênico N one. Derreta uma alíquota de 5% de fluoresceína enclausurada conjugada com dextrana em cloreto de potássio 0,2 molar sobre gelo. Dilua a fluoresceína enclausurada em cloreto de potássio 0,2 molar até uma concentração final de 1%. Mantenha a fluoresceína sobre gelo e proteja-a da luz. Permita que os cruzamentos de peixe-zebra acasalem, colete os ovos fertilizados assim que forem postos e lave-os conforme descrito no texto. Use uma pipeta plástica para transferir embriões em estágio de uma célula para uma placa de injeção contendo 1% de aros, previamente recoberta com meio E três fresco, sob um microscópio estereoscópico.

Use a pipeta para posicionar os embriões nas canaletas de injeção. Quebre a ponta de uma agulha de injeção capilar que tenha sido puxada até formar uma ponta longa e fina. Use uma ponteira de microcarregador para preencher a agulha por trás com aproximadamente um microlitro de fluoresceína caged a 1%.

Coloque a agulha carregada em um micromanipulador acoplado a um microinjetor pneumático. Injete em cada embrião de dois a três nanolitros de fluoresceína ativada diretamente no citoplasma da célula. Injete pelo menos 50 embriões por experimento.

Transfira os embriões injetados para uma placa de Petri contendo meio E3 fresco e incube no escuro a 28,5 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado. Iniba a pigmentação adicionando 0,1% de feniltiourea aos embriões após 24 horas para preparar o montagem dos embriões. Revesta placas de Petri de 15 a 20 mm com uma camada fina de 1% de agarose dissolvida em meio E2 fresco; após a solidificação da agarose, preencha a placa com meio E2 sob um microscópio estereoscópico.

Use pinças finas para colocar os embriões injetados em placas revestidas. Evite expor os embriões ao ar. Mantenha uma alíquota de 2% de agarose de ponto de fusão baixo em água.

Em um bloco de aquecimento a 72 graus Celsius. Use uma pipeta de vidro polida ao fogo para transferir um embrião revestido em aproximadamente 150 microlitros de meio para uma placa de Petri de 60 milímetros. Coloque um volume semelhante de Aros 2% ao lado do embrião e misture rapidamente as duas gotas para obter uma gota homogênea de Agros 1%.

Oriente o embrião com seu lado dorsal voltado para a objetiva. Deixe o aros solidificar e submerja o embrião embutido no meio E2. Coloque o embrião recém-montado sobre um suporte de placa sob um microscópio de dois fótons equipado com um laser de mesa giratória de banda larga.

Antes de iniciar o processo de fotoativação, adquira uma série de imagens da borda mais ventral até a dorsal do tecido que expressa, com espaçamento de 860 nanômetros. As imagens devem ser capturadas a cada seis mícrons no plano Z. Selecione o plano Z alvo para fotoativação e coloque-o em foco utilizando GFP como referência.

Localize a região de interesse. Adquira uma única imagem em 860 nanômetros e mantenha-a aberta em uma janela separada para o alinhamento adequado. É fundamental que o laser em 720 nanômetros esteja em estado bloqueado em modo antes de abrir o menu editar fotobranqueamento.

Utilize a imagem capturada a 860 nanômetros para definir a região de interesse ou ROI para a fotoativação. Na janela de edição de clareamento, ajuste a potência relativa do laser, o número de iterações e a velocidade de varredura. Para a fotoativação, pressione clarear quando o laser parar, retorne a 860 nanômetros e adquira uma imagem de um único plano para avaliar a intensidade do material fotoativado resultante.

Colete uma pilha de imagens para avaliar o zsan ou a espessura do domínio ativado. Dessa forma, é possível determinar empiricamente a intensidade do laser e a duração da exposição. Para uma fotoativação ideal de cada clone ou foto cruzada, ative todos os embriões restantes para o experimento.

Usando essas condições, eleve os embriões fotoativados montados no escuro a 28,5 graus Celsius em meio E2 contendo 0,1% de fenil tioureia até que atinjam o estágio de desenvolvimento desejado. Sob um microscópio estereoscópico, use um bisturi pontiagudo para fazer um entalhe em forma de V nas arótidas próximo ao embrião montado, com a ponta do entalhe voltada para a cabeça do embrião. Posicione um par de pinças fechadas no ponto do entalhe.

Abra suavemente a pinça separando os anéis ao longo do comprimento do embrião e libere o embrião no meio. Após liberar cada embrião, utilize uma pipeta Pasteur flamejada para coletá-lo em um tubo de microcentrífuga. Em uma capela de exaustão química, fixe os embriões com formaldeído 4% por três horas.

À temperatura ambiente, prossiga com a desidratação, reidratação e coloração com fosfatase alcalina conjugada anti-fluoresceína, e todas as lavagens associadas conforme descrito no texto complementar. Adicione 500 microlitros de solução filtrada de fast red aos embriões. Incube no escuro à temperatura ambiente, repõe com nova solução de coloração com fast red a cada hora até que a relação sinal/fundo desejada seja alcançada.

Interrompa a reação de coloração com três lavagens em PBST de cinco minutos cada. Na câmara de exaustão, fixe a coloração em formaldeído 4% por 20 minutos. Lave duas vezes em PBST por cinco minutos cada.

Lave os embriões claros através de uma série de gradientes de glicerol a 25%, 50% e 75% em PBS até que cada embrião se sedimente no fundo do tubo. Armazene os embriões a quatro graus Celsius até o momento da visualização ao microscópio. Para montar os embriões para visualização, use uma seringa de um mililitro para aplicar quatro gotas de 20 microlitros de graxa de silicone transparente nos cantos de um quadrado de 15 milímetros em uma lâmina de microscopia.

Coloque um embrião em aproximadamente 200 microlitros de glicerol a 75% entre as gotas de graxa. Coloque uma lamínula sobre o embrião. Pressione suavemente a lamínula diretamente para baixo até que a solução de glicerol preencha o espaço.

O espaço entre as gotas de óleo com embriões montados pode ser armazenado por alguns dias a quatro graus Celsius antes da visualização por microscopia confocal. Esta imagem mostra um embrião de peixe-zebra vivo expressando GFP sob o controle de neurogen. Em um promotor que foi injetado com corante traçador de fluoresceína "caged" no estágio de uma célula utilizando o método descrito, no estágio de três a cinco somitos.

Uma área distinta dos quatro cérebros primordiais foi fotoativada por laser de dois fótons e o corante traçador de fluoresceína liberado pôde ser detectado. Após o procedimento de fotoativação, o embrião foi incubado a 28,5 graus Celsius, e as células cerebrais contendo a fluoresceína liberada foram rastreadas por imunomarcação anti-fluoresceína em vermelho às 24 horas pós-fertilização. Observe o pequeno número de células marcadas. Uma vez dominado, o procedimento de fotoativação pode ser realizado em apenas algumas horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de controlar os parâmetros ideais, permitindo uma fotoativação precisa com resolução de célula única.