Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é fotoativar um determinado agente responsivo à luz, como um corante fluorescente quimicamente enjaulado em um embrião de peixe-zebra vivo em resolução de célula única. Isso é alcançado injetando um agente responsivo à luz em embriões de estágio único expressando uma marca genética viva para localizar e direcionar precisamente quaisquer células de interesse. Como segundo passo, os embriões são cultivados e montados em um aeros de baixo ponto de fusão, que imobiliza o embrião vivo.

Em seguida, a microscopia de dois fótons é usada para localizar uma marca transgênica fluorescente visível. O agente responsivo à luz é então ativado em um plano focal desejado e a extensão da fotoativação é monitorada. O destino das células marcadas resultantes pode então ser rastreado em estágios embrionários posteriores.

Este procedimento pode ser utilizado para a ativação de uma variedade de compostos em resolução de célula única em espécimes vivos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia confocal ou lâmpada de flash, é que ela permite a fotoativação de tecidos relativamente profundos no nível axial de alguns mícrons com baixa fototoxicidade. Mas o método apresentado aqui é usado para rastreamento de borda seline e pode ser aplicado para fotoativação de uma variedade de componentes, permitindo controle direcionado sobre processos de desenvolvimento e fisiológicos. Na noite anterior à injeção, prepare tanques de acasalamento separando machos e fêmeas de peixe-zebra transgênico expressando uma marca fluorescente visível.

Neste experimento, a linha transgênica expressa GFP sob o controle do promotor N one neurogênico. Descongele uma aliquota de 5% de dextran conjugado com fluoresceína enjaulada em cloreto de potássio 0,2 molar no gelo. Dilua a fluoresceína enjaulada em cloreto de potássio 0,2 molar para uma concentração final de 1%. Mantenha a fluoresceína no gelo e proteja-a da luz. Permita que os cruzamentos de peixe-zebra acasale, colecione os ovos fertilizados assim que forem postos e enxágue-os conforme descrito no texto. Use uma pipeta plástica para transferir embriões de estágio único para uma placa de injeção de 1% aros que tenha sido recoberta com meio E três fresco sob um microscópio de dissecação.

Use a pipeta para orientar os embriões nos sulcos de injeção. Quebre a ponta de uma agulha de injeção capilar que foi puxada para um longo cone. Use uma ponta de micro carregador para preencher a agulha com aproximadamente um microlitro de fluoresceína enjaulada 1%.

Coloque a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um microinjetor pneumático. Injete cada embrião com dois a três nanolitros de fluoresceína enjaulada diretamente no citoplasma da célula. Injete pelo menos 50 embriões por experimento.

Transfira os embriões injetados para uma placa de Petri contendo meio E três fresco. Incube no escuro a 28,5 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado para inibir a pigmentação a 0,1% de Fenil threa nos embriões a 24 horas para preparar a montagem do embrião. Revestimento 15 a 2060 milímetros placas de Petri com uma fina camada de 1% Aros dissolvido em meio E dois fresco quando o aros tiver solidificado. Encha a placa com meio E dois sob um microscópio de dissecação.

Use pinças afiadas para revestir os embriões injetados nas placas revestidas. Evite expor os embriões ao ar. Mantenha uma aliquota de 2% aros de baixo ponto de fusão em água.

Em um bloco térmico a 72 graus Celsius. Use uma pipeta pasteur polida a fogo para transferir um embrião revestido em aproximadamente 150 microlitros de meio para uma placa de petri de 60 milímetros. Coloque um volume similar de 2% aros ao lado do embrião e misture rapidamente as duas gotas para obter uma gota homogênea de 1% Agros.

Oriente o embrião com seu lado dorsal voltado para a lente objetiva. Permita que o aros se solidifique, submerja o embrião incorporado em meio E dois. Coloque o embrião recém-montado em um suporte de placa sob um microscópio de dois fótons equipado com um laser de plataforma de banda larga.

Antes de iniciar o processo de fotoativação, adquira uma série de imagens da borda mais ventral à dorsal do tecido expressante a 860 nanômetros e espaço. As imagens a seis mícrons de distância no plano Z. Selecione o plano Z alvo para fotoativação e traga-o ao foco usando GFP como uma marca.

Localize a região de interesse. Tire uma única imagem a 860 nanômetros e mantenha-a aberta em uma janela separada para o alinhamento adequado. É crucial que o laser a 720 nanômetros esteja em um estado bloqueado por modo antes de abrir o menu de branqueamento de edição.

Use a imagem tirada a 860 nanômetros para definir a região de interesse ou ROI para fotoativação. Na janela de edição de branqueamento, ajuste o número de potência relativa do laser, iterações e velocidade de varredura. Para fotoativação, pressione branquear quando o laser tiver parado, mude de volta para 860 nanômetros e adquira uma imagem de plano único para avaliar a intensidade do material fotoativado resultante.

Colecione uma pilha de imagens para avaliar o zsan ou espessura do domínio ativado. Dessa forma, é possível determinar empiricamente a intensidade do laser e a duração da exposição. Para fotoativação ideal de cada clone ou foto cruzada, ative todos os embriões restantes para o experimento.

Usando essas condições, cultive os embriões fotoativados montados no escuro a 28,5 graus Celsius em meio E dois contendo 0,1% de tiouréia fenila até que atinjam o estágio de desenvolvimento desejado. Sob um microscópio de dissecação, use uma estilete pontiagudo para fazer um entalhe em forma de V no aros próximo ao embrião montado com o fundo do entalhe apontado para a cabeça do embrião. Coloque um conjunto de pinças fechadas no ponto do entalhe.

Abra suavemente as pinças separando o aros ao longo do comprimento do embrião e soltando o embrião no meio. Após liberar cada embrião, use uma pipeta pasteur polida a fogo para coletá-lo em um tubo de microcentrífuga. Em uma capela de fumo químico, fixe os embriões com 4% de formaldeído por três horas.

À temperatura ambiente, prossiga com a desidratação, reidratação, coloração com fosfatase alcalina, conjugada, anti-fluorescelina e todas as lavagens associadas, conforme descrito no texto de acompanhamento. Adicione 500 microlitros de solução vermelha rápida filtrada aos embriões. Incube no escuro à temperatura ambiente, reabastecendo com nova solução de coloração vermelha rápida a cada hora até que a proporção sinal-ruído desejada seja alcançada.

Interrompa a reação de coloração com três lavagens em PBST de cinco minutos cada. Na capela de fumo, fixe a tintura em 4% de formaldeído por 20 minutos. Lave duas vezes em PBST por cinco minutos cada.

Lave os embriões transparentes através de uma série de gradientes de glicerol 25%, 50% e 75% em PBS até que cada embrião esteja assentado no fundo do tubo. Armazene os embriões a quatro graus Celsius até estarem prontos para visualização no microscópio. Para montar os embriões para visualização, use uma se