Medir o Complemento de 50% hemolítica (CH ₅₀) Atividade de soro

Medição da atividade complemento CH 50 hemolítica a 50% do soro. Você precisará de uma pipeta capaz de dispensar 200 microlitros e de outra capaz de dispensar 1000 microlitros, soro de teste armazenado em gelo, eritrócitos de carneiro sensibilizados, solução salina tamponada com varone e tubos com água destilada para o teste, senhor, e tubos para a linha de base e lise total, um misturador vortex e uma placa de 96 poços com fundo plano, rotulando os tubos individualmente com controle e a diluição final. Neste caso, iniciamos com uma diluição de um para oito.

Continue com diluições em duplicata, resultando em diluições de um em 16, um em 32, um em 64 e um em 128, rotulando os tubos restantes como branco e lise total. Depois que todos os tubos tiverem sido rotulados, você já pode começar a diluir seu soro de teste. Comece transferindo 300 microlitros de solução salina R para um tubo novo.

Agora transfira 100 microlitros de soro para 300 microlitros de solução salina R. Isso lhe dará uma diluição inicial de um para quatro. Certifique-se de que a amostra de soro seja completamente homogeneizada.

Agora transfira 200 microlitros de solução salina tamponada roal para os tubos previamente rotulados. Além disso, adicione 200 microlitros de solução salina tamponada roal aos dois tubos em branco, somando aos tubos de lise total. Adicione 200 microlitros de água destilada, não solução salina tamponada Verona.

Agora transfira 200 microlitros do soro diluído na proporção de um para quatro para o tubo rotulado um para oito. Anteriormente, transferimos 200 microlitros de solução salina al tampão para os tubos da série um para oito até um para cento e vinte e oito. Isso agora resultará em uma diluição de um para oito.

Agite bem a amostra e, em seguida, transfira 200 microlitros para o tubo rotulado um em 16. Continue até que toda a série de tubos tenha sido diluída. Descarte 200 microlitros da diluição um em 128 para que o volume final seja de 200 microlitros.

As hemácias de ovelha sensibilizadas podem ter sedimentado ao longo do tempo. Será necessário ressuspendê-las invertendo suavemente o tubo várias vezes. Após ressuspendidas completamente, transfira 200 microlitros das hemácias de ovelha sensibilizadas para cada um dos tubos preparados.

Certifique-se de que o soro esteja completamente misturado com os glóbulos vermelhos. Os glóbulos vermelhos de carneiro sensibilizados adicionados ao tubo em branco permitirão determinar a lise espontânea, enquanto o sangue adicionado ao tubo de lise total permitirá determinar o valor de 100%. Usando um misturador vortex ajustado em velocidade baixa, misture suavemente cada um dos tubos. Em seguida, coloque os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius e incube por 30 minutos.

Após 15 minutos, vórtex suavemente os tubos mais uma vez e incube por mais 15 minutos. Após a incubação, transfira os tubos para uma centrífuga ajustada a quatro graus Celsius e centrifugue a 1500 ×g por cinco minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos e coloque-os em um suporte apropriado. Aqui você verá o pellet de hemácias, enquanto o SNA aparecerá vermelho.

Devido à liberação da transferência de hemoglobina, adicione 100 microlitros de água destilada ao número necessário de poços de uma placa de fundo plano com nove a seis poços. Tendo o cuidado de evitar a transferência do pellet, transfira 100 microlitros do sobrenadante S para um poço apropriado da placa de nove a seis poços. Após todas as amostras terem sido carregadas na placa, leia a absorção utilizando um espectrofotômetro de placa ajustado em 540 nanômetros.

Aqui temos os dados brutos de absorção para as duas réplicas. A um e B um. Refira-se à diluição um em oito.

Em seguida, temos os dados para 1 em 16, 1 em 32, 1 em 64 e 1 em 128. A6 e B6 são as amostras branco. Já A7 e B7 são a lise total.

Uma vez que os dados tenham sido coletados, você precisa calcular a absorção média para cada amostra em duplicata. Em seguida, subtraia a absorbância do branco, que representa a lise espontânea, de todas as amostras. Após a coleta de todos os dados, você pode agora calcular a porcentagem de lise para cada diluição utilizando a seguinte fórmula.

Uma vez que todos os dados tenham sido calculados, trace a porcentagem de lise no eixo vertical em função da diluição do soro no eixo horizontal. O gráfico resultante pode então ser usado para calcular a diluição do soro necessária para lisar 50% das hemácias sensibilizadas. Este gráfico mostra a porcentagem de lise plotada em função da diluição do soro.

Pode-se então traçar uma linha a partir de 50% de lise até que ela intercepte a curva. No ponto em que a curva é interceptada, traça-se uma linha vertical descendente até o eixo horizontal. Esse valor representa a diluição em série pela qual o soro deve ser diluído para garantir 50% de lise. Ao comparar duas amostras de soro para determinar se há diferença no CH 50, a diluição que fornece 50% de lise pode ser usada como uma me.