Name: Medir o Complemento de 50% hemolítica (CH 50) Atividade de soro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-29T18:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a realizar o ensaio CH 50 para medir a atividade do complemento em amostras de soro usando hemólise de eritrócitos sensibilizados. Este método auxilia no diagnóstico de deficiências imunológicas.

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O autor gostaria de agradecer a senhorita Lora Matthews para executar a técnica eo Sr. Paul Pastor para a cinematografia. Este projeto foi financiado pela Universidade da Austrália do Sul, Laboratório curso de Medicina.

Preparação de Saline Veronal 5x Buffered (VBS) <ol><li> Para preparar a solução salina Veronal Buffered (VBS), três soluções distintas precisa estar preparado. </li><li> Prepare uma solução através da dissolução de NaCl e 21.25gm 0.94gm de Barbitone de sódio em 350ml de água destilada. A concentração final de NaCl e de sódio Barbitone são 1,02 e 13mm, respectivamente. </li><li> Prepare a solução 2, dissolvendo 1.44gm de Barbitone em 125ml de água destilada quente. A concentração final de Barbitone é 62,5 mm. </li><li> Prepare a solução 3 dissolvendo 20.33gm de MgCl 2 e 4.41gm de CaCl 2 em 100ml de água destilada. A concentração final de MgCl 2 e CaCl 2 é 2.18m e 440mm, respectivamente. </li><li> Mix de soluções 1 e 2 e arrefecer à temperatura ambiente. </li><li> Uma vez que a solução combinada tenha arrefecido, adicione 1.25ml de solução 3 e ajustar o pH a 7,3-7,5 usando HCl 1M. </li><li> Ajustar o volume final de 500ml com água destilada para preparar uma solução estoque de 5x. </li><li> Para preparar uma solução 1x de trabalho, diluir a 1:05 estoque com água destilada. </li></ol> Sensibilização de hemácias de carneiro com hemolisina <ol><li> Prepare a hemolisina, em primeiro lugar diluição 1:50 com VBS </li><li> Para adicionar 4ml de SRBC 6ml de VBS e misture delicadamente por inversão </li><li> Centrifugar a 600g x 5 minutos </li><li> Desprezar o sobrenadante e lavar as células mais 2 vezes </li><li> Após a lavagem final, centrifugar as células de 900g x 5 minutos para arrumar as células </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em VBS suficiente para preparar uma solução de 10% ou seja, 0,5 ml de hemácias são ressuspenso em 5 ml de tampão </li><li> Gotas adicionar igual volume de hemolisina (coelho anti-ovelha anticorpos de glóbulos vermelhos) para as células enquanto agita continuamente </li><li> Incubar a 30 ° C por 30 minutos em banho-maria </li><li> Misture suavemente as células a cada 15 minutos </li><li> SRBC sensibilizados podem ser armazenados durante a noite a 4 ° C </li></ol> CH 50 ensaio <ol><li> Rotular uma série de tubos em duplicata com 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 e 1:128. </li><li> Prepare uma série de duas diluições de controle e soro em cada VBS em duplicado </li><li> Início às 01:04 (100ml + 300ml de soro VBS) e transferência de 200ml de amostra dentro do tubo próxima rotulados. </li><li> Misturar bem entre diluições e 200ml de transferência para a diluição seguinte com uma ponteira de pipeta nova. </li><li> Repita até que todos os cinco diluições são feitas. </li><li> Descartar 200ml da diluição 1:128 final. </li><li> Adicione 200 ml de suspensão SRBC sensibilizados para todos os tubos. </li><li> Identifique dois tubos separados como em branco e adicionar 200ml de sensibilizados SRBC + 200ml VBS. Estes tubos medirá lise espontânea do SRBC na VBS. </li><li> Rótulo mais dois tubos separados como lise TOTAL e adicionar 200ml de água + 200ml SRBC sensibilizados destilada. </li><li> Misture suavemente todos os tubos. </li><li> Incubar a 37 ° C por 30 minutos em banho-maria misturando após 15 minutos. </li><li> Centrifugar as amostras a 1.500 g por 5 minutos para sedimentar as hemácias. </li><li> Transferência de 100ml do sobrenadante de cada tubo para um bem em uma placa inferior 96 bem plana. </li><li> Adicione 100 ml de água destilada para cada poço. </li><li> Ler a absorbância das amostras em 540 nm usando um espectrofotômetro de placas. </li></ol> Cálculos <ol><li> Calcular a média de absorbância para cada amostra </li><li> Subtrair a absorbância BLANK (lise espontânea) de todas as amostras </li><li> Calcular a lise% para cada diluição com a seguinte fórmula: <img src="/files/ftp_upload/1923/1923eq1.jpg" alt="Equação" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação"></li><li> Plotar a porcentagem de lise (eixo vertical) versus a diluição de soro no eixo horizontal. </li><li> Calcular a diluição necessária para a hemólise 50% para o controle e soro de ensaio (Fig. 2). </li></ol> Resultados representativos: O vídeo inclui um exemplo de resultados representativos. Na prática, um soro de controlo também é executado ao mesmo tempo, como o soro de teste e é tratado da mesma maneira. Abaixo (Tabela 1) são os dados da amostra a partir de uma amostra testada soro. Os dados são manipulados de acordo com a equação apresentada em 5.3. <table border="1"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> OD 540 </td><td> Média </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Em branco </td><td> 0,042, 0,044 </td><td> 0,043 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lise total </td><td> 0,183, 0,183 </td><td> 0,183 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td> Diluição </td><td> OD 540 </td><td> Média </td><td> Dizer-Blank </td><td> Lise% </td></tr><tr><td> 01:08 </td><td> 0,200, 0,219 </td><td> 0,210 </td><td> 0,168 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 01:16 </td><td> 0,179, 0,173 </td><td> 0,176 </td><td> 0,134 </td><td> 93 </td></tr><tr><td> 01:32 </td><td> 0,134, 0,110 </td><td> 0,122 </td><td> 0,08 </td><td> 55 </td></tr><tr><td> 1:64 </td><td> 0,053, 0,066 </td><td> 0,059 </td><td> 0,017 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 1:128 </td><td> 0,044, 0,045 </td><td> 0,045 </td><td> 0,003 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table><img src="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Ativação da via clássica do complemento. A via clássica é ativada pela ligação imunoglobulina M (IgM) ou imunoglobulina g (IgG) na superfície de uma célula-alvo. A porção Fc da Ab liga a C1q, C1r é ativado e este por sua vez ativa outra molécula de C1r que, juntos, ativar duas moléculas de C1s. C1s agora cliva C4 que expõe o sítio de ligação para C2 que também é clivada. A ligação do C4b e C2a leva à formação de um complexo chamado de C3 convertase. Este complexo cliva C3 formando agora C3a e C3b, alguns dos quais combinam com o C3 convertase formando uma convertase C5. Este complexo age agora em C5, com a resultante C5b ligação com C6 iniciando a formação do complexo de ataque à membrana (MAC). C5b6 atua em C7, que por sua vez funcionam em C8 e C9 em última análise, resultando na formação do MAC final. (Goldsby et al, 2003). <img src="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Plotagem de dados de amostra e cálculo do CH50 para um controle e amostra de soro. (A), a percentagem calculada (%) lise de tanto o controle (•) e teste () amostras de soro são plotados contra o fator de diluição. (B) Para calcular a lise de 50%, uma linha é desenhada a partir do valor percentual de 50% até se cruza com as linhas do gráfico e, em seguida, uma linha vertical é traçada até a diluição. Neste exemplo, uma diluição de 35 vezes, do controle e 21,6 vezes diluição do soro de teste são necessários para alcançar a lise de 50%. Estes dados indicam que há menos complemento presente no soro de teste em relação ao controle, uma vez que necessitou de menos de diluição, antes de lise de 50% foi alcançado. A amostra de controlo também mostra lise&gt; 100% na diluição de 1:08. Isto é provavelmente devido a lise incompleta do SRBC pela água destilada e mais eficiente lise pelos componentes do complemento.

<ol><li>Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldsby%2C+RA+%22Immunology%22">Immunology</a>. , W.H. Freeman. (2003).</li>
</ol>

O CH 50 ensaio está sujeito a muitas interferências. Alguns SRBC são mais frágeis do que outros, resultando em hemólise espontânea que não está relacionado para complementar a atividade. A afinidade do anticorpo de coelho varia de lote para lote e de um fabricante para outro, o que afeta a quantidade de anticorpo que se liga ao SRBC. Além disso, o processo de sensibilização SRBC com resultados de anticorpos em células com diferentes quantidades de anticorpos do revestimento SRBC. Coleta e armazenamento são um...

<table><tbody><tr><td>Hemácias de ovelha</td><td>CSL</td><td>2490201</td><td>Usar em concentração final de 1%</td></tr><tr><td>Soro</td><td></td><td></td><td>Soro humano</td></tr><tr><td>Soro hemolítico anti-ovelha de coelho (HCOs), não conjugado</td><td>AbD Serotec</td><td>C12HSB</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços com fundo plano</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com veronal</td><td></td><td></td><td>Usar em concentração final 1x</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora/sala a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medir o complemento de 50% hemolítica (ch 50) atividade de soro

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

O sistema complemento é um grupo de proteínas que, quando ativado levar a meta a lise das células e facilita a fagocitose através opsonisation. Componentes do complemento individual pode ser quantificado no entanto, este não fornece qualquer informação sobre a atividade da via. O CH<sub&gt; 50</sub&gt; É um ensaio de triagem para a ativação da via clássica do complemento (Fig. 1) e é sensível à redução, ausência e / ou inatividade de qualquer componente da via. O CH<sub&gt; 50</sub&gt; Testa a capacidade funcional de componentes do complemento sérico da via clássica para lisar hemácias de carneiro (SRBC) pré-revestida com anticorpos de coelho anti-células vermelhas do sangue de ovelhas (hemolisina). Quando revestidos com anticorpo SRBC são incubadas com soro de teste, a via clássica do complemento é ativado e os resultados hemólise. Se um componente do complemento está ausente, o CH<sub&gt; 50</subNível&gt; será zero, se um ou mais componentes da via clássica estão diminuídas, o CH<sub&gt; 50</sub&gt; Vai ser diminuída. Um volume fixo de SRBC ideal sensibilizados é adicionado a cada diluição do soro. Após a incubação, a mistura é centrifugada eo grau de hemólise é quantificada pela medida da absorbância da hemoglobina liberada no sobrenadante a 540 nm. A quantidade de atividade complementar é determinada examinando a capacidade de várias diluições do soro de ensaio para lisar SRBC revestidas de anticorpo. Este vídeo descreve os passos envolvidos na análise experimental do nível de atividade complementar da via clássica do complemento.

A via clássica é ativada por anticorpos e culmina com a lise das células alvo. O CH<sub&gt; 50</subEnsaio&gt; fornece uma medida da atividade de complemento de uma amostra de soro. Este vídeo mostra os passos envolvidos na determinação do CH<sub&gt; 50</sub&gt; De uma amostra de soro, os cálculos e interpretação de resultados.

Medir o Complemento de 50% hemolítica (CH 50) Atividade de soro

O sistema complemento é um grupo de proteínas que, quando ativado, leva à lise da célula-alvo e facilita a fagocitose por meio da opsonização. Individual...

Medição da atividade complemento CH 50 hemolítica a 50% do soro. Você precisará de uma pipeta capaz de dispensar 200 microlitros e de outra capaz de dispensar 1000 microlitros, soro de teste armazenado em gelo, eritrócitos de carneiro sensibilizados, solução salina tamponada com varone e tubos com água destilada para o teste, senhor, e tubos para a linha de base e lise total, um misturador vortex e uma placa de 96 poços com fundo plano, rotulando os tubos individualmente com controle e a diluição final. Neste caso, iniciamos com uma diluição de um para oito.Continue com diluições em duplicata, resultando em diluições de um em 16, um em 32, um em 64 e um em 128, rotulando os tubos restantes como branco e lise total. Depois que todos os tubos tiverem sido rotulados, você já pode começar a diluir seu soro de teste. Comece transferindo 300 microlitros de solução salina R para um tubo novo.Agora transfira 100 microlitros de soro para 300 microlitros de solução salina R. Isso lhe dará uma diluição inicial de um para quatro. Certifique-se de que a amostra de soro seja completamente homogeneizada.Agora transfira 200 microlitros de solução salina tamponada roal para os tubos previamente rotulados. Além disso, adicione 200 microlitros de solução salina tamponada roal aos dois tubos em branco, somando aos tubos de lise total. Adicione 200 microlitros de água destilada, não solução salina tamponada Verona.Agora transfira 200 microlitros do soro diluído na proporção de um para quatro para o tubo rotulado um para oito. Anteriormente, transferimos 200 microlitros de solução salina al tampão para os tubos da série um para oito até um para cento e vinte e oito. Isso agora resultará em uma diluição de um para oito.Agite bem a amostra e, em seguida, transfira 200 microlitros para o tubo rotulado um em 16. Continue até que toda a série de tubos tenha sido diluída. Descarte 200 microlitros da diluição um em 128 para que o volume final seja de 200 microlitros.As hemácias de ovelha sensibilizadas podem ter sedimentado ao longo do tempo. Será necessário ressuspendê-las invertendo suavemente o tubo várias vezes. Após ressuspendidas completamente, transfira 200 microlitros das hemácias de ovelha sensibilizadas para cada um dos tubos preparados.Certifique-se de que o soro esteja completamente misturado com os glóbulos vermelhos. Os glóbulos vermelhos de carneiro sensibilizados adicionados ao tubo em branco permitirão determinar a lise espontânea, enquanto o sangue adicionado ao tubo de lise total permitirá determinar o valor de 100%. Usando um misturador vortex ajustado em velocidade baixa, misture suavemente cada um dos tubos. Em seguida, coloque os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius e incube por 30 minutos.Após 15 minutos, vórtex suavemente os tubos mais uma vez e incube por mais 15 minutos. Após a incubação, transfira os tubos para uma centrífuga ajustada a quatro graus Celsius e centrifugue a 1500 ×g por cinco minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos e coloque-os em um suporte apropriado. Aqui você verá o pellet de hemácias, enquanto o SNA aparecerá vermelho.Devido à liberação da transferência de hemoglobina, adicione 100 microlitros de água destilada ao número necessário de poços de uma placa de fundo plano com nove a seis poços. Tendo o cuidado de evitar a transferência do pellet, transfira 100 microlitros do sobrenadante S para um poço apropriado da placa de nove a seis poços. Após todas as amostras terem sido carregadas na placa, leia a absorção utilizando um espectrofotômetro de placa ajustado em 540 nanômetros.Aqui temos os dados brutos de absorção para as duas réplicas. A um e B um. Refira-se à diluição um em oito.Em seguida, temos os dados para 1 em 16, 1 em 32, 1 em 64 e 1 em 128. A6 e B6 são as amostras branco. Já A7 e B7 são a lise total.Uma vez que os dados tenham sido coletados, você precisa calcular a absorção média para cada amostra em duplicata. Em seguida, subtraia a absorbância do branco, que representa a lise espontânea, de todas as amostras. Após a coleta de todos os dados, você pode agora calcular a porcentagem de lise para cada diluição utilizando a seguinte fórmula.Uma vez que todos os dados tenham sido calculados, trace a porcentagem de lise no eixo vertical em função da diluição do soro no eixo horizontal. O gráfico resultante pode então ser usado para calcular a diluição do soro necessária para lisar 50% das hemácias sensibilizadas. Este gráfico mostra a porcentagem de lise plotada em função da diluição do soro.Pode-se então traçar uma linha a partir de 50% de lise até que ela intercepte a curva. No ponto em que a curva é interceptada, traça-se uma linha vertical descendente até o eixo horizontal. Esse valor representa a diluição em série pela qual o soro deve ser diluído para garantir 50% de lise. Ao comparar duas amostras de soro para determinar se há diferença no CH 50, a diluição que fornece 50% de lise pode ser usada como uma me.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Para efetivamente estudar a função de populações de células imunes sua purificação é muitas vezes necessária. Esgotamento complemento é uma técnica rápida e barata para o isolamento de populações de células imunes, com alta pureza.

Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

Hemaglutinação é uma forma de aglutinação, onde anticorpos se ligam às células vermelhas do sangue. Os glóbulos vermelhos são facilmente disponíveis e os resultados são facilmente observáveis ​​a olho nu. Este vídeo mostra os passos envolvidos em um ensaio de hemaglutinação, interpretando os resultados e determinar o título.

Determinação da Reatividade e Titre de soro usando um ensaio de hemaglutinação

Este estudo descreve um ensaio que mede a microplaca novel FV actividade de coagulação, durante a formação de coágulos de fibrina no plasma humano, que não havia sido descrita anteriormente. O método utiliza um leitor de microplacas cinético para medir continuamente a variação da absorvância a 405 nm durante a formação de coágulos de fibrina no plasma humano.

Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos presentes no soro. Essa abordagem combina soro isolado com bactérias patogênicas e proteínas exógenas do complemento. Após a incubação, as bactérias são cultivadas em uma placa de ágar e as colônias produzidas são quantificadas para medir o título bactericida sérico.

Um ensaio bactericida sérico para a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos

O vídeo demonstra um ensaio de inibição da hemaglutinação para detectar anticorpos séricos contra antígenos específicos. A confirmação da inibição da hemaglutinação no poço de teste e da hemaglutinação no poço de controle é obtida por meio de padrões visuais distintos. Este ensaio desempenha um papel crucial na avaliação da resposta imune, na eficácia da vacina e no estudo de infecções virais em virologia e imunologia.

O ensaio de inibição da hemaglutinação para detectar anticorpos séricos contra um antígeno alvo

Este vídeo demonstra ensaios de microneutralização para medir anticorpos neutralizantes usando células renais caninas Madin-Darby que superexpressam ácido siálico ligado a α2,6 em soros humanos. Este ensaio é frequentemente usado para sorologia humana para...

Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

Aqui nós descrevemos dois ensaios para medir a ativação do complemento induzida por anticorpos contra células vermelhas do sangue. A vantagem principal sobre os ensaios actuais é a sua natureza quantitativa e fácil de interpretar.

Métodos para a detecção quantitativa de anticorpos induzida pela ativação do complemento no Glóbulos Vermelhos

A exposição do sangue a condutos sanguíneos poliméricos inicia a reação de corpo estranho que tem sido implicada em complicações clínicas. Aqui, o Chandler Loop Apparatus, uma ferramenta experimental que imita a perfusão sanguínea através desses condutos, é descrito. O apêndice do CD47 recombinante resulta em diminuição da evidência da reação de corpo estranho nesses condutos.

O uso do Ex Vivo Chandler Circuito Aparelho para avaliar a biocompatibilidade de Modificados Condutas sangue Poliméricos

Aqui apresentamos um método simples para medir a atividade da quitinase em fluidos biológicos, como lavagem broncoalveolar ou soro.

Medição da atividade da quitinase em amostras biológicas

Este protocolo descreve uma avaliação abrangente da hemocompatibilidade de dispositivos de contato com o sangue usando implantes neurovasculares cortados a laser. Um modelo de loop de fluxo com sangue humano fresco e heparinizado é aplicado para imitar o fluxo sanguíneo. Após a perfusão, vários marcadores hematológicos são analisados e comparados aos valores obtidos diretamente após a coleta de sangue para avaliação da hemocompatibilidade dos dispositivos testados.

Teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue em um modelo de loop de fluxo imitando o fluxo sanguíneo humano

O objetivo deste método é determinar a densidade cr1 nos eritrócitos de qualquer sujeito, comparando-se com três sujeitos cuja densidade eritrócito CR1 é conhecida. O método utiliza citometria de fluxo após a imunocoloração dos eritrócitos dos sujeitos por um anticorpo monoclonal anti-CR1 acoplado a um sistema amplificado usando ficoitrina (PE).

Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo

Aprenda a realizar o ensaio CH 50 para medir a atividade do complemento em amostras de soro usando hemólise de eritrócitos sensibilizados. Este método auxilia no diagnóstico de deficiências imunológicas.

Medir o Complemento de 50% hemolítica (CH₅₀) Atividade de soro

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