Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana

Examinar as respostas do fitocromo em tipos específicos de células vegetais. Armadilha intensificadora GAL 4G FP e linhas transgênicas U-A-S-B-V-R para produzir fitocromo deficiente. Os protoplastos foliares da progênie GA 4G FP cruzados U-A-S-B-V-R são isolados de plantas.

Em seguida, os protoplastos são classificados por fatos para isolar protoplastos GFP negativos e GFP positivos em amostras separadas, protoplastos isolados são analisados por microscopia confocal de varredura a laser. Para confirmar a coleção de protoplastos positivos para GFP, o RNA é extraído dos protoplastos e analisado espectralmente. Olá, sou Sanka Pivar do laboratório da BARDA Montgomery no Laboratório de Pesquisa de Usinas do Departamento de Energia da Michigan State University.

Hoje mostraremos um procedimento para isolar protoplastos de folhas do topo do ANA para classificação de células assistida por fluorescência e análise de expressão gênica específica do tipo de célula. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar as respostas dependentes de fitocromo específicas de tecidos e órgãos. Então vamos começar.

A linhagem de ARADIDO Um é de uma biblioteca de linhas de armadilha intensificadora com diferentes padrões de gal ou expressão. O pai um também expressa GFP sob o controle de uma sequência de ativação upstream ou UAS.

Em suma, o fator de transcrição GA quatro ativa qualquer gene colocado sob o controle do UAS. Na linha pai um GA quatro ativa GFP pai um foi cruzado com pai dois no pai dois. O gene BVR está sob o controle de GAL quatro através de UAS.

A linha resultante do cruzamento é a cruz U-A-S-B-V-R G 4G FP.In as linhagens parentais, a biossíntese do fitocromo cromo quatro procede de um LA através de heme para biver abreviado bv. Mas na progênie, o produto do gene BVR bloqueia a biogênese do cromóforo do fitocromo, reduzindo o precursor BV. Esta linha de progênie BVR de armadilha intensificadora foi confirmada e pode ser usada para examinar como uma redução nos níveis de fitocromo ativo afeta diferentes tecidos vegetais.

Comece este procedimento preparando solo e vasos para o cultivo de plantas, a fim de gerar protoplastos de folhas. Assim, sementes esterilizadas em torno de 2000 por amostra por experimento no solo em vasos. Água é adicionada ao fundo da bandeja contendo os potes e toda a bandeja é coberta com filme plástico.

Cultive as plantas por cinco semanas sob iluminação branca a 22 graus Celsius e 70% de umidade. Após os primeiros cinco a seis dias, a germinação das sementes é confirmada e o filme plástico é removido da bandeja. Para isolar protoplastos, primeiro prepare o tampão TEX para um litro de tampão, pese os GA's B, cinco sais, MES, cloreto de cálcio, nitrato de amônio e sacarose.

Dissolva os componentes completamente em cerca de 900 mililitros de água destilada deionizada. Abreviado DD H2O e traga o pH para 5,7 com um molar KOH. Em seguida, traga o volume final para um litro e esterilize o filtro.

Em seguida, colete folhas verdes saudáveis das plantas. Colete cerca de 250 mililitros de folhas frouxamente embaladas em um copo. Lave as folhas com 40 mililitros.

DD H2O quatro vezes seguido de enxágue duas vezes com DD H2O estéril usando um bisturi número 20. Corte as folhas em tiras finas e divida o tecido igualmente em dois tubos de plástico estéreis de 50. Uma mistura de digestão de folhas é preparada adicionando uma alíquota de cinco mililitros de 10 x solução estoque preparada dissolvendo 2% de peso para volume labiríntico R 10 e 4% de peso para celulase de volume em azua R 10 em tampão TEX a 45 mililitros de tampão TEX fresco.

Adicione cerca de 25 mililitros de uma digestão de uma folha. Misture com as tiras de folhas em cada tubo para que todo o tecido foliar seja coberto. Prossiga para aspirar, infiltre o tecido foliar na digestão.

Misture em tubos abertos por uma hora em temperatura ambiente usando um dessecador a vácuo conectado a uma bomba d'água. Mantenha os tubos da tampa contendo o tecido foliar e a mistura de digestão das folhas envoltos em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Em seguida, incubatório de três horas em temperatura ambiente em um balancim com agitação suave.

Após três horas, aumente a velocidade do balancim por dois minutos para liberar os protoplastos. Filtrar a suspensão de protoplastos brutos através de duas camadas de gaze estéril para remover o abri e recolher o filtrado num copo de vidro estéril. Filtrar o filtrado através de uma malha de nylon estéril de 100 micrómetros para uma placa de Petri estéril.

Recolha o fluxo e transfira-o para um novo tubo estéril de 50 mililitros. Use cerca de 15 a mililitros de tampão TEX fresco para lavar o prato petro estéril e coletar quaisquer protoplastos durante a superfície. Centrifugue o fluxo a 100 vezes a gravidade a 10 graus Celsius por 15 minutos usando uma centrífuga de balde oscilante com aceleração definida para seis e desaceleração em zero quando a centrifugação estiver completa.

Use uma massa de vidro estéril de nove polegadas por animal conectada a uma bomba peristáltica para remover cerca de 25 a 30 mililitros do líquido abaixo da camada flutuante de protoplastos, que contém detritos residuais e peletizados sem perturbar a camada flutuante de protoplastos, deixando cerca de 10 a 50 mililitros. Depois de remover os detritos peletizados, adicione tampão TEX fresco a um volume final de 40 mililitros. Enquanto suspende suavemente os protoplastos, repita a remoção de detritos e a suspensão dos protoplastos flutuantes restantes.

Mais duas vezes para remover o máximo possível de detritos celulares D. O tempo de centrifugação é reduzido para 10 minutos na primeira repetição e para cinco minutos na repetição final. Finalmente, use uma pipeta de transferência estéril de um mililitro para aspirar os protoplastos flutuantes e transferi-los para um novo tubo de 15 mililitros.

Prossiga diretamente para a classificação antes da classificação. Examine os protoplastos por microscopia confocal de varredura a laser ou CLSM, usando um laser de 488 nanômetros para excitação para confirmar a integridade dos protoplastos e a presença de fluorescência GFP no pool de protoplastos. O mínimo de detritos diurnos é necessário para evitar o entupimento do bico de classificação, classificando os PROTOPLASTS isolados no buffer TEX via fax.

Usando um bico de 200 micrômetros em um cabeçote de classificação macro a taxas de eventos entre 6.000 e 15.000 com uma pressão de sistema de cerca de nove PSI seguindo um protocolo adaptado, use PROTOPLASTOS não GFP do tipo selvagem para determinar os limiares de autofluorescência para coletar células de classificação de protoplastos positivos para GFP usando um ar chamado laser Argonne operado a 100 miliwatts em uma linha de argônio de 488 nanômetros. Identificar a fluorescência GFP usando um filtro passa-banda 530 slash 30 após a coleta de protoplastos positivos GFP. Novamente, examine os protoplastos classificados ao microscópio como antes do início da classificação para o perfil de expressão.

Extrair o RNA total dos protoplastos classificados. O CDNA pode então ser preparado para hibridização. O CD NA é então submetido para hibridização a uma matriz de genoma completo TH one OPSYS Ametri

Aqui estão alguns resultados representativos de protoplastos classificando o controle de tipo selvagem. Os protoplastos não possuem sinais na porta positiva GFP. No entanto, sinais positivos de GFP são identificados para amostras de protoplastos isoladas de linhas GAL 4G FP antes da classificação de protoplastos isolados de plantas selvagens sem qualquer fluorescência de GFP nas análises CLSM.

Considerando que uma mistura de protoplastos sem e exibindo fluorescência GFP é detectada em amostras de protoplastos de linhas GAL 4G FP após os fatos. A análise CLSM indica que o isolamento de PROTOPLASTS positivos para GFP de um RNA de linha 4G FP gal representativo é extraível de protoplastos isolados e um mililitro produz quantidade suficiente de RNAA para detecção por espectrometria de flúor. Acabamos de mostrar como isolar protoplastos foliares de ANA atopia para classificação de células assistida por fluorescência e análise de expressão gênica específica do tipo de célula.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de ser gentil no manuseio dos protoplastos e limitar sua exposição à luz. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.