Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana

Para examinar as respostas da fitocromo em tipos celulares vegetais específicos. O GAL 4G FP com armadilha de realçador e linhagens transgênicas U-A-S-B-V-R são cruzadas para produzir deficiência de fitocromo. Protoplastos foliares de progênie U-A-S-B-V-R cruzados com GA 4G FP são isolados das plantas.

Em seguida, os protoplastos são separados por meio de FACs para isolar protoplastos GFP negativos e protoplastos GFP positivos em amostras separadas; os protoplastos isolados são analisados por microscopia confocal de varredura a laser. Para confirmar a coleta de protoplastos GFP positivos, o RNA é extraído dos protoplastos e analisado espectralmente. Olá, sou Sanka Pivar do laboratório de BARDA Montgomery no Departamento de Pesquisa de Plantas do Laboratório Nacional de Pesquisa Energética da Michigan State University.

Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento de protoplastos foliares de uma planta ANA para triagem celular assistida por fluorescência e análise de expressão gênica específica por tipo celular. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar respostas dependentes de fitocromos específicas de tecidos e órgãos. Então, vamos começar.

A linhagem ANA de Arabidopsis utilizada neste procedimento foi gerada por uma abordagem de rastreamento de potenciador bifuncional. Um dos progenitores é proveniente de uma biblioteca de linhagens de rastreamento de potenciador com diferentes padrões de expressão de gal ou. O progenitor um também expressa GFP sob o controle de uma sequência de ativação upstream ou UAS.

Resumidamente, o fator de transcrição GA4 ativa qualquer gene colocado sob o controle do UAS. Na linhagem parental um, o GA4 ativa a GFP; o parental um foi cruzado com o parental dois, no qual o gene BVR está sob o controle do GAL4 por meio do UAS.

A linhagem resultante do cruzamento é U-A-S-B-V-R cruzado com G 4G FP. Nas linhagens parentais, a biossíntese do cromóforo de fitocromo quatro procede a partir de LA, passando pelo heme até o biver, abreviado como bv. Porém, na prole, o produto do gene BVR bloqueia a biogênese do cromóforo de fitocromo ao reduzir o precursor BV. Essa linhagem de prole com armadilha de potenciador BVR foi confirmada e pode ser utilizada para examinar como a redução nos níveis ativos de fitocromo afeta diferentes tecidos vegetais.

Inicie este procedimento preparando o solo e os vasos para o cultivo de plantas, a fim de gerar protoplastos foliares. Semeie cerca de 2000 sementes esterilizadas por amostra por experimento em solo nos vasos. Adicione água na base da bandeja contendo os vasos e cubra toda a bandeja com filme plástico.

Cultive as plantas por cinco semanas sob iluminação branca a 22 °C e 70% de umidade. Após os primeiros cinco a seis dias, confirme a germinação das sementes e remova o filme plástico da bandeja. Para isolar protoplastos, prepare primeiro o tampão TEX; para um litro do tampão, pese os sais GA's B cinco, MES, cloreto de cálcio, nitrato de amônio e sacarose.

Dissolva completamente os componentes em cerca de 900 mililitros de água destilada desionizada, abreviada como DD H2O, e ajuste o pH para 5,7 com KOH 1 M. Em seguida, complete o volume final para um litro e esterilize por filtração.

Em seguida, colete folhas verdes e saudáveis das plantas. Reúna cerca de 250 mililitros de folhas levemente compactadas em um béquer. Enxágue as folhas com 40 mililitros.

DD H2O quatro vezes, seguido por duas lavagens com DD H2O estéril usando um bisturi número 20. Corte as folhas em tiras finas e divida igualmente o tecido em dois tubos plásticos estéreis de 50. Prepara-se uma mistura de digestão de folhas x adicionando uma alíquota de cinco mililitros de solução estoque 10 x, preparada pela dissolução de 2% peso por volume de mazy R 10 e 4% peso por volume de celulase on azua R 10 em tampão TEX, a 45 mililitros de tampão TEX fresco.

Adicione cerca de 25 mililitros de uma digestão x foliar. Misture com as tiras de folha em cada tubo de modo que todo o tecido foliar fique coberto. Prossiga para o vácuo, infiltrando o tecido foliar na digestão.

Incube em tubos abertos por uma hora à temperatura ambiente utilizando um dessecador a vácuo conectado a uma bomba de água. Mantenha os tubos contendo o tecido foliar e a mistura de digestão da folha envoltos em papel alumínio para evitar exposição à luz. Em seguida, realize uma incubação de três horas à temperatura ambiente em um agitador com movimento suave.

Após três horas, aumente a velocidade do agitador por dois minutos para liberar os protoplastos. Filtre a suspensão bruta de protoplastos por duas camadas de gaze estéril para remover resíduos e colete o filtrado em um béquer de vidro estéril. Filtre o filtrado por uma malha de náilon estéril de 100 micrômetros em um recipiente de Petri estéril.

Colete o fluxo e transfira-o para um novo tubo estéril de 50 mililitros. Utilize cerca de 15 a mililitros de tampão TEX fresco para lavar a placa de Petri estéril e recolher quaisquer protoplastos aderidos à superfície. Centrifugue o fluxo a 100 vezes a gravidade a 10 graus Celsius por 15 minutos, utilizando uma centrífuga com rotor de balde oscilante, com aceleração ajustada em seis e desaceleração em zero ao término da centrifugação.

Utilize uma haste de vidro estéril de nove polegadas conectada a uma bomba peristáltica para remover cerca de 25 a 30 mililitros do líquido abaixo da camada de protoplastos flutuantes, que contém resíduos e debris pelotizado, sem perturbar a camada de protoplastos flutuantes, deixando cerca de 10 a 50 mililitros. Após a remoção do debris pelotizado, adicione tampão TEX fresco até um volume final de 40 mililitros. Enquanto ressuspende suavemente os protoplastos, repita a remoção do debris e a ressuspensão dos protoplastos flutuantes remanescentes.

Mais duas vezes, a fim de remover o máximo possível de detritos celulares D. O tempo de centrifugação é reduzido para 10 minutos na primeira repetição e para cinco minutos na última repetição. Por fim, utilize uma pipeta de transferência estéril de um mililitro para aspirar os protoplastos flutuantes e transferi-los para um novo tubo de 15 mililitros.

Prossiga diretamente para a triagem antes da triagem. Examine os protoplastos por microscopia confocal a laser ou CLSM, em resumo, utilizando um laser de 488 nanômetros para excitação, a fim de confirmar a integridade dos protoplastos e a presença de fluorescência GFP na população de protoplastos. É necessário o mínimo de detritos celulares para evitar entupimento do bico de triagem; triagem de PROTOPLASTOS isolados em tampão TEX via fax.

Usando um bico de 200 micrômetros em uma cabeça de separação macro com taxas de eventos entre 6.000 e 15.000 e pressão do sistema de aproximadamente nove PSI, seguindo um protocolo adaptado, utilize protoplastos selvagens não GFP para determinar os limiares de autofluorescência e coletar protoplastos positivos para GFP, separando as células com um laser de argônio operado a 100 miliwatts em uma linha de argônio de 488 nanômetros. Para identificar a fluorescência GFP, utilize um filtro passa-banda de 530/30. Após a coleta dos protoplastos positivos para GFP, examine novamente os protoplastos separados ao microscópio, como antes do início da separação, para análise de perfil de expressão.

Extraia o RNA total dos protoplastos classificados. Em seguida, o cDNA pode ser preparado para hibridização. O cDNA é então submetido à hibridização com matrizes genômicas inteiras TH one OPSYS Ametri.

Aqui estão alguns resultados representativos da triagem de protoplastos do controle do tipo selvagem. Os protoplastos não apresentam quaisquer sinais no canal positivo para GFP. No entanto, sinais positivos para GFP são identificados em amostras de protoplastos isoladas de linhagens GAL4GFP antes da triagem, enquanto protoplastos isolados de plantas do tipo selvagem não apresentam qualquer fluorescência GFP nas análises por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).

Enquanto uma mistura de protoplastos com e sem fluorescência GFP é detectada em amostras de protoplastos de linhagens GAL 4G FP após fatos. A análise por microscopia confocal de varredura a laser indica o isolamento de protoplastos GFP positivos a partir de uma linhagem representativa GAL 4G FP. O RNA pode ser extraído dos protoplastos isolados, e um mililitro fornece quantidade suficiente de RNAA para detecção por fluoroespectrometria. Acabamos de mostrar como isolar protoplastos foliares de atopia ANA para triagem celular assistida por fluorescência e análise de expressão gênica específica por tipo celular.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular os protoplastos com cuidado e limitar sua exposição à luz. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.