Name: Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a isolar protoplastos foliares de Arabidopsis thaliana para análise de expressão gênica específica por tipo celular usando FACS. Este método permite investigar respostas fitocromo em tecidos específicos.

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Trabalho no laboratório Montgomery nas respostas fitocromo em plantas é apoiado pela National Science Foundation (Grant no. MCB-0919100 para BLM) e Ciências Químicas, Geociências e Biociências Divisão do Escritório de ciências básicas da energia, o Office of Science, EUA Departamento de energia (não concedem. FG02 DE 91ER20021 a BLM). Agradecemos a Melissa Whitaker de assistência técnica durante as filmagens e leitura crítica do manuscrito, Stephanie Costigan de assistência experimental, Dr. Luís Rei de assistência ao desenvolvimento e otimização de fluorescência-Activated Celular classificação protocolos para a classificação de protoplastos Arabidopsis e Frame Dr. Melinda para assistência com confocal microscopia. Agradecemos a Marlene Cameron para a assistência de design gráfico e Bird Karen de assistência editorial.

1. Crescimento da Planta <ol><li> Confirmado UAS-BVR X GAL4-GFP linha armadilha enhancer isoladas como descrito 4 (Para um resumo ver Fig. 1.) E as linhas do tipo selvagem ou parental são semeadas em solo, ou seja, ~ 2000 sementes esterilizadas por linha. </li><li> As plantas são cultivadas por 5 semanas em solo sob iluminação branca de 100 μmolm -2 s -1 a 22 ° C e umidade de 70%. </li></ol> 2. Folha de protoplastos de isolamento (adaptado de Denecke Vitale e 9) <ol><li> Para isolar protoplastos, prepare TEX buffer. Para um buffer de litros TEX, pesar os seguintes componentes: 3,1 g sais Gamborg do B5, 0,5 g 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES, 2,56 mM), 0,75 g cloreto de cálcio dihidratado (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g nitrato de amónio (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g de sacarose (0,4). Dissolve componentes completamente em ~ 900 ml de água, deionizada (DDH 2 O) e trazer o pH para 5,7 com 1 M KOH. Trazer um volume final de 1 litro e filtro de esterilizar com uma garrafa de 0,2 m top-filtro ligado a uma bomba de vácuo. </li><li> Colete verde, folhas sadias de plantas (~ 250 ml de folhas ligeiramente comprimido em um copo) e enxaguar com ~ 40 ml DDH 2 O 4 vezes, seguido de lavagem duas vezes com estéril DDH 2 O. Usando um bisturi # 20, as folhas cortadas em tiras finas e dividir o tecido igualmente em dois tubos de 50 ml de plástico estéril. Prepare 1x mistura de digestão de folhas, adicionando 5 ml de alíquota 10x solução estoque folha digestão (10x folha solução estoque digestão: dissolver 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v celulase "Onozuka" R-10 em TEX buffer, filtro de esterilizar com 0,2 m de filtro e congelar alíquotas 5 ml a -80 ° C) a 45 ml de tampão TEX fresco. Adicionar ~ 25 ml de 1x mix de folhas digestão por 50 ml tubo para cobrir todo o tecido da folha. </li><li> Vácuo infiltrar tecido foliar em mistura de digestão em tubos abertos para 1 hora em temperatura ambiente usando um exsicador de vácuo conectada a uma bomba de água, seguido de 3 horas de incubação a temperatura ambiente em um rocker, agitando suavemente. Tubos tampados com tecido foliar no mix de folhas 1x digestão são mantidos embrulhados em papel alumínio durante este processo para evitar a exposição à luz. </li><li> Após 3 horas, aumentar a velocidade rocker por aproximadamente 2 minutos para liberação de protoplastos. Filtrar a suspensão de protoplastos bruto por meio de duas camadas de pano de queijo estéril para remover detritos e recolher o filtrado em um copo de vidro esterilizado. Filtrar o filtrado através de uma malha de nylon estéril 100 mícrons em uma placa de Petri estéril. Recolher o fluxo através de e transferi-lo para um tubo novo ml estéril 50. Use cerca de 15-20 ml de tampão TEX fresca para lavar a placa de Petri estéril e coletar qualquer protoplastos aderindo à superfície. </li><li> Centrifugar o fluxo através da utilização de um rotor balde swing em 100xg a 10 ° C por 15 min (6 Aceleração, Desaceleração 0). </li><li> Remover ~ 25 - 30 ml do líquido abaixo da camada flutuante de protoplastos, que contém os restos residuais e peletizada, com uma estéril 9 "de vidro Pasteur pipeta conectado a uma bomba peristáltica, sem perturbar a camada flutuante de protoplastos e deixando ~ 10-15 ml de volume. </li><li> Adicionar tampão TEX fresco para um volume final de 40 ml, enquanto delicadamente ressuspender a protoplastos. </li><li> Repita os passos 2,5-2,7 duas vezes para remover o máximo possível os restos celulares. O tempo de centrifugação é reduzida para 10 minutos na primeira repetição e cinco minutos na repetição final. </li><li> Aspirar protoplastos flutuante com um corte, uma pipeta de transferência estéril ml em um tubo ml novo 15. Prosseguir diretamente para a classificação ou armazenar no escuro por até 2 horas a 4 ° C até a classificação. </li></ol> 3. Classificando de protoplastos por Fluorescência-activated cell sorting (FACS) <ol><li> Antes da separação, examine protoplastos por Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM) usando um laser de 488 nm para excitação para confirmar a integridade de protoplastos ea presença de fluorescência da GFP na piscina de protoplastos. Detritos mínima é necessária para evitar o entupimento do bico de classificação FACS. </li><li> Ordenar protoplastos isolados em TEX tampão via FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences), utilizando um bico 200 mícrons em uma cabeça tipo macro na taxa de eventos entre 6.000 e 15.000, com um sistema de pressão de cerca de 9 psi na sequência de um protocolo adaptado 10. </li><li> Tipo selvagem não GFP-protoplastos são usados ​​para determinar os limiares autofluorescência. </li><li> Para coletar GFP positivas protoplastos, células de ordenação usando um ar-refrigerado laser de argônio (Spectra Physics Modelo 177 de Newport Corporation, Irvine, CA) operado com 100 mW em uma linha de argônio 488-nm para identificar GFP fluorescência usando uma banda 530/30 filtro passa. </li><li> Após a coleta de GFP-positivos protoplastos, examine protoplastos classificadas por CLSM conforme detalhado no passo 3.1. </li><li> Extrato de RNA total a partir de protoplastos classificados usando um Qiagen Usina RNeasy Kit Mini. cDNA pode então ser preparado para hibridação, conforme descrito no Affymetrix GeneChip ExprManual de Análise Técnica e ession então hibridizado com ATH1 Arabidopsis Affymetrix arrays genoma inteiro. </li></ol> Resultados representante Detectamos um número significativo de células positivas para GFP-no canal de GFP por FACS (Fig. 2). Em ensaios de otimização usando GFP enhancer trap-pais, o constitutivamente expressando GFP-line, J0571, exibido ~ 17% a 24% GFP positivas protoplastos, enquanto que a linha com a expressão vascular e cutânea, J1071, tinha ~ 1,4% GFP positivas protoplastos (Tabela 1). Classificação de 3 x 500 mL (~ total de 1,5 ml de suspensão de protoplastos) de J0571 protoplastos por 1 h ~ GFP deu positivo 100.000 protoplastos. Classificação de 3 x 500 mL (~ 1,5 ml de suspensão de protoplastos total) de J1071 protoplastos por 1,5 h deu ~ 3000 GFP positivas protoplastos. Imagens confocal indicaram um rendimento muito elevado de protoplastos para amostras tanto J0571 e J1071 antes da separação foi realizada (Fig. 3C e 3E), e as frações classificadas continha apenas brilhante fluorescente GFP-protoplastos (Fig. 3G e dados não mostrados). Este achado confirma que intacta GFP positivas protoplastos podem ser classificados através FACS. Os protoplastos não GFP também podem ser classificados e recolhidos em um canal separado. Os protoplastos não GFP servir como um controle ideal negativo para análises posteriores microarray para detectar as alterações na expressão de genes específicos na redução dos níveis de holophytochrome. A extração de RNA a partir de protoplastos isolados (1 ml) produz RNA em quantidade suficiente para a detecção por fluorospectrometry (Fig. 4). Isolado RNA foi avaliada através de um instrumento NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) e quantificados por NanoDrop software quantificação 3.7.1 RNA. Produz RNA a partir de pré-classificados C24 do tipo selvagem ou protoplastos FACS-classificados, GFP-positivos protoplastos armadilha enhancer excedeu o ng 20 mínimos necessários para utilização em RNA-rotulagem ensaios para microarray (Tabela 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Enhancer Linha Armadilha </td><td> % Da GFP positivas protoplastos </td><td> Número de protoplastos GFP classificadas </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17,18% ~ 24,06% </td><td> 26400 ~ 36000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1,43% </td><td> 1000 ~ 1300 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Percentagem de GFP-positivos protoplastos de duas linhas enhancer trap antes da separação e do número de GFP-positivos protoplastos coletados, executando 500 mL da suspensão de protoplastos através da fluorescência celular Sorter Ativado (FACSVantage, BD). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Linha de plantas </td><td> RNA rendimento (ng) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486,5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71,5 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Rendimento de RNA isolamento de protoplastos. RNA foi isolado a partir de pré-classificados C24 do tipo selvagem ou classificados GFP positivas protoplastos a partir de duas linhas armadilha enhancer e quantificados. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. GAL4 enhancer-trap baseada indução de biliverdina redutase (BVR) expressão em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana. (A). Um indivíduo selecionado de uma biblioteca de GAL4 baseado linhas enhancer trap, que contêm um GAL4-responsive gene marcador GFP, pode ser cruzada com uma linha contendo um gene-alvo GAL4 de resposta para induzir a expressão do gene alvo em GAL4 contendo células marcadas GFP por fluorescência. Baseado em uma figura do Dr. Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Produção de fitocromo cromóforo, phytochromobilin (PΦB) e holophytochrome em linhas pai. (C) esquerda, redução da biliverdina IXα (BV IXα) e pela biliverdina redutase PΦB (BVR) atividade a BR e PΦR, respectivamente. Atividade resulta em depleção de BVR PΦB e leva a uma redução na produção de fotoativo holophytochrome. Direita, a reação catalisada pela BVR é mostrado. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Separação de células de fluorescência Ativado (FACS) parcelas dot aquisição. Comparação de células de protoplastos de classificação para C24 do tipo selvagem (A), J0571 (B) e J1071 (C). (A) gráfico de pontos Aquisição de não-fluorescente GFP C24 do tipo selvagem protoplastos animado por um 488-nm laser de argônio e usado para determinar o limiar autofluorescência. (B) e (C) parcelas dot aquisição mostram proporções de protoplastos, que são GFP positivas em resposta à excitação por um laser 488 nm. R3 portões classificação em B e C delimitar as metas GFP-positivos que foram ordenados por Fluorescência-Activated Sorter Cell (FACSVantage, BD) e recolhidos. Canal vermelho indica valores de autofluorescência de clorofila a partir de protoplastos e canal verde indica valores para GFP fluorescência. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microscopia confocal de protoplastos de plantas utilizadas na separação de células. Confocal a laser imagens digitalizadas antes de protoplastos (A, C, E) e depois (G) a classificação através de fluorescência-Activated Sorter Cell (FACS). B, D, F e H são imagens DIC. Protoplastos de C24 do tipo selvagem (A, B), J1071 (C, D) e J0571 (E, F, G, H) são mostrados. Imagens C, E e G são mescladas imagens de fluorescência da GFP (BP 505 nm - 575 nm) e autofluorescência (LP 650 nm) obtidos a partir de excitação com um laser 488 nm. A a H são média de 4 scans sob óleo 63x. Bar = 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Quantificação do RNA isolado de protoplastos por fluorospectrometry. RNA extraído de (A) do tipo C24 selvagem, (B) J0571, e (C) J1071. A indica RNA para a pré-classificadas do tipo selvagem protoplastos. B e C indicam RNA de GFP-positivos protoplastos classificadas por Fluorescência-activated cell sorting (FACS). RNA software de quantificação, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

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</ol>

Perfil de expressão gênica através de microarrays (1) indicou que mais de 30% dos genes em Arabidopsis mudas são leves regulamentados e 11 (2) identificou um vasto conjunto de genes que codificam proteínas de transdução de sinal de luz envolvidos na cascata de sinalização fitocromo 12, 13 . Tais experimentos sugerem que a luz induz a mudanças rápidas e de longo prazo na expressão genética. Cada pool de fitocromos pode controlar apenas um subconjunto de respostas de desenvolvimento e de adaptação. A...

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-BVR</td><td>QED Bioscience Inc.</td><td>56257-100</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase &amp;#8220;Onozuka&amp;#8221; R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>MSPC 0930</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de sais basais B5 de Gamborg&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5768</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>PTC 001</td><td></td></tr><tr><td>MES, baixo teor de umidade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Sais de Murashige e Skoog</td><td>Caisson Laboratories</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>Phytablend</td><td>Caisson Laboratories</td><td>28302</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant Minikit</td><td>Qiagen</td><td>16419</td><td></td></tr></tbody></table>

investigando tecido e órgãos específicos responses fitocromo usando facs assistida célula tipo profiling expressão específica no arabidopsis thaliana</em

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Media luz uma série de processos de desenvolvimento e de adaptação ao longo do ciclo de vida de uma planta. Plantas utilizam a luz de absorção de moléculas chamadas fotorreceptores de sentir e adaptar-se a luz. O vermelho / vermelho-extremo de absorção de luz fotorreceptores fitocromo têm sido estudadas extensivamente. Fitocromos existir como uma família de proteínas com funções distintas e sobrepostas em todos os sistemas de plantas superiores em que foram estudados<sup&gt; 1</sup&gt;. Respostas mediadas por fitocromo luz, que vão desde a germinação de sementes através de floração e senescência, muitas vezes são localizadas em tecidos de plantas específicas ou órgãos<sup&gt; 2</sup&gt;. Apesar da descoberta e elucidação das funções individuais e redundantes fitocromo através de análises de mutação, os relatórios conclusivos sobre locais distintos de photoperception e os mecanismos moleculares de piscinas localizadas de fitocromos que medeiam espacial respostas específicas fitocromo são limitadas. Nós projetamos experimentos baseados em hipóteses que os sites específicos de photoperception fitocromo regular tecido e órgão os aspectos específicos da photomorphogenesis, e que piscinas localizadas fitocromo envolver subconjuntos distintos de genes-alvo a jusante na célula a célula de sinalização. Nós desenvolvemos uma abordagem bioquímica para seletivamente reduzir fitocromos funcional em um órgão ou tecido-específicas maneira dentro de plantas transgênicas. Nossos estudos são baseados em uma abordagem enhancer trap-bipartite que resulta em transativação da expressão de um gene sob o controle da ativação elemento Seqüência Upstream (UAS) do ativador transcricional GAL4<sup&gt; 3</sup&gt;. A biliverdina redutase (<em&gt; BVR</em&gt;) Gene sob o controle da UAS é mantido em silêncio, na ausência de transativação GAL4 no pai UAS-BVR<sup&gt; 4</sup&gt;. Cruzamentos genéticos entre uma linhagem transgênica UAS-BVR e um GAL4-GFP enhancer resultado linha de armadilha em expressão específica do<em&gt; BVR</em&gt; Gene nas células marcadas pela<em&gt; GFP</em&gt; Expressão<sup&gt; 4</sup&gt;. BVR acumulação em plantas de Arabidopsis resultados na deficiência cromóforo fitocromo<em&gt; Em planta</em<sup&gt; 07/05</sup&gt;. Assim, plantas transgênicas que temos produzido ativação exibem GAL4-dependente da<em&gt; BVR</em&gt; Gene, resultando na inativação bioquímicos do fitocromo, bem como GAL4-dependente<em&gt; GFP</em&gt; Expressão. Fotobiológicos molecular e análises genéticas de<em&gt; BVR</em&gt; Linhas de transgênicos estão rendendo introspecção em tecido e órgão-específicas mediadas por fitocromo respostas que têm sido associados a sites correspondentes de photoperception<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. Separação de células de fluorescência Ativado (FACS) da GFP-positivo, enhancer-armadilha induzida<em&gt; BVR</emProtoplastos&gt; expressando planta juntamente com células de tipo específico de perfil de expressão gênica através da análise de microarray está sendo usado para identificar supostos genes alvo downstream envolvidos na mediação espacial respostas específicas fitocromo. Esta pesquisa está se expandindo a nossa compreensão dos sítios de percepção de luz, os mecanismos através dos quais vários tecidos ou órgãos cooperam entre si à luz regulado o crescimento das plantas e desenvolvimento, e promover a dissecção molecular do fitocromo mediada por complexo celular-para-celular cascatas de sinalização.

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

A luz media uma série de processos adaptativos e de desenvolvimento ao longo do ciclo de vida de uma planta. As plantas utilizam moléculas absorvedoras de luz chamadas ...

Para examinar as respostas da fitocromo em tipos celulares vegetais específicos. O GAL 4G FP com armadilha de realçador e linhagens transgênicas U-A-S-B-V-R são cruzadas para produzir deficiência de fitocromo. Protoplastos foliares de progênie U-A-S-B-V-R cruzados com GA 4G FP são isolados das plantas.Em seguida, os protoplastos são separados por meio de FACs para isolar protoplastos GFP negativos e protoplastos GFP positivos em amostras separadas; os protoplastos isolados são analisados por microscopia confocal de varredura a laser. Para confirmar a coleta de protoplastos GFP positivos, o RNA é extraído dos protoplastos e analisado espectralmente. Olá, sou Sanka Pivar do laboratório de BARDA Montgomery no Departamento de Pesquisa de Plantas do Laboratório Nacional de Pesquisa Energética da Michigan State University.Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento de protoplastos foliares de uma planta ANA para triagem celular assistida por fluorescência e análise de expressão gênica específica por tipo celular. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar respostas dependentes de fitocromos específicas de tecidos e órgãos. Então, vamos começar.A linhagem ANA de Arabidopsis utilizada neste procedimento foi gerada por uma abordagem de rastreamento de potenciador bifuncional. Um dos progenitores é proveniente de uma biblioteca de linhagens de rastreamento de potenciador com diferentes padrões de expressão de gal ou. O progenitor um também expressa GFP sob o controle de uma sequência de ativação upstream ou UAS.Resumidamente, o fator de transcrição GA4 ativa qualquer gene colocado sob o controle do UAS. Na linhagem parental um, o GA4 ativa a GFP; o parental um foi cruzado com o parental dois, no qual o gene BVR está sob o controle do GAL4 por meio do UAS.A linhagem resultante do cruzamento é U-A-S-B-V-R cruzado com G 4G FP. Nas linhagens parentais, a biossíntese do cromóforo de fitocromo quatro procede a partir de LA, passando pelo heme até o biver, abreviado como bv. Porém, na prole, o produto do gene BVR bloqueia a biogênese do cromóforo de fitocromo ao reduzir o precursor BV. Essa linhagem de prole com armadilha de potenciador BVR foi confirmada e pode ser utilizada para examinar como a redução nos níveis ativos de fitocromo afeta diferentes tecidos vegetais.Inicie este procedimento preparando o solo e os vasos para o cultivo de plantas, a fim de gerar protoplastos foliares. Semeie cerca de 2000 sementes esterilizadas por amostra por experimento em solo nos vasos. Adicione água na base da bandeja contendo os vasos e cubra toda a bandeja com filme plástico.Cultive as plantas por cinco semanas sob iluminação branca a 22 °C e 70% de umidade. Após os primeiros cinco a seis dias, confirme a germinação das sementes e remova o filme plástico da bandeja. Para isolar protoplastos, prepare primeiro o tampão TEX; para um litro do tampão, pese os sais GA's B cinco, MES, cloreto de cálcio, nitrato de amônio e sacarose.Dissolva completamente os componentes em cerca de 900 mililitros de água destilada desionizada, abreviada como DD H2O, e ajuste o pH para 5,7 com KOH 1 M. Em seguida, complete o volume final para um litro e esterilize por filtração.Em seguida, colete folhas verdes e saudáveis das plantas. Reúna cerca de 250 mililitros de folhas levemente compactadas em um béquer. Enxágue as folhas com 40 mililitros.DD H2O quatro vezes, seguido por duas lavagens com DD H2O estéril usando um bisturi número 20. Corte as folhas em tiras finas e divida igualmente o tecido em dois tubos plásticos estéreis de 50. Prepara-se uma mistura de digestão de folhas x adicionando uma alíquota de cinco mililitros de solução estoque 10 x, preparada pela dissolução de 2% peso por volume de mazy R 10 e 4% peso por volume de celulase on azua R 10 em tampão TEX, a 45 mililitros de tampão TEX fresco.Adicione cerca de 25 mililitros de uma digestão x foliar. Misture com as tiras de folha em cada tubo de modo que todo o tecido foliar fique coberto. Prossiga para o vácuo, infiltrando o tecido foliar na digestão.Incube em tubos abertos por uma hora à temperatura ambiente utilizando um dessecador a vácuo conectado a uma bomba de água. Mantenha os tubos contendo o tecido foliar e a mistura de digestão da folha envoltos em papel alumínio para evitar exposição à luz. Em seguida, realize uma incubação de três horas à temperatura ambiente em um agitador com movimento suave.Após três horas, aumente a velocidade do agitador por dois minutos para liberar os protoplastos. Filtre a suspensão bruta de protoplastos por duas camadas de gaze estéril para remover resíduos e colete o filtrado em um béquer de vidro estéril. Filtre o filtrado por uma malha de náilon estéril de 100 micrômetros em um recipiente de Petri estéril.Colete o fluxo e transfira-o para um novo tubo estéril de 50 mililitros. Utilize cerca de 15 a mililitros de tampão TEX fresco para lavar a placa de Petri estéril e recolher quaisquer protoplastos aderidos à superfície. Centrifugue o fluxo a 100 vezes a gravidade a 10 graus Celsius por 15 minutos, utilizando uma centrífuga com rotor de balde oscilante, com aceleração ajustada em seis e desaceleração em zero ao término da centrifugação.Utilize uma haste de vidro estéril de nove polegadas conectada a uma bomba peristáltica para remover cerca de 25 a 30 mililitros do líquido abaixo da camada de protoplastos flutuantes, que contém resíduos e debris pelotizado, sem perturbar a camada de protoplastos flutuantes, deixando cerca de 10 a 50 mililitros. Após a remoção do debris pelotizado, adicione tampão TEX fresco até um volume final de 40 mililitros. Enquanto ressuspende suavemente os protoplastos, repita a remoção do debris e a ressuspensão dos protoplastos flutuantes remanescentes.Mais duas vezes, a fim de remover o máximo possível de detritos celulares D. O tempo de centrifugação é reduzido para 10 minutos na primeira repetição e para cinco minutos na última repetição. Por fim, utilize uma pipeta de transferência estéril de um mililitro para aspirar os protoplastos flutuantes e transferi-los para um novo tubo de 15 mililitros.Prossiga diretamente para a triagem antes da triagem. Examine os protoplastos por microscopia confocal a laser ou CLSM, em resumo, utilizando um laser de 488 nanômetros para excitação, a fim de confirmar a integridade dos protoplastos e a presença de fluorescência GFP na população de protoplastos. É necessário o mínimo de detritos celulares para evitar entupimento do bico de triagem; triagem de PROTOPLASTOS isolados em tampão TEX via fax.Usando um bico de 200 micrômetros em uma cabeça de separação macro com taxas de eventos entre 6.000 e 15.000 e pressão do sistema de aproximadamente nove PSI, seguindo um protocolo adaptado, utilize protoplastos selvagens não GFP para determinar os limiares de autofluorescência e coletar protoplastos positivos para GFP, separando as células com um laser de argônio operado a 100 miliwatts em uma linha de argônio de 488 nanômetros. Para identificar a fluorescência GFP, utilize um filtro passa-banda de 530/30. Após a coleta dos protoplastos positivos para GFP, examine novamente os protoplastos separados ao microscópio, como antes do início da separação, para análise de perfil de expressão.Extraia o RNA total dos protoplastos classificados. Em seguida, o cDNA pode ser preparado para hibridização. O cDNA é então submetido à hibridização com matrizes genômicas inteiras TH one OPSYS Ametri.Aqui estão alguns resultados representativos da triagem de protoplastos do controle do tipo selvagem. Os protoplastos não apresentam quaisquer sinais no canal positivo para GFP. No entanto, sinais positivos para GFP são identificados em amostras de protoplastos isoladas de linhagens GAL4GFP antes da triagem, enquanto protoplastos isolados de plantas do tipo selvagem não apresentam qualquer fluorescência GFP nas análises por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).Enquanto uma mistura de protoplastos com e sem fluorescência GFP é detectada em amostras de protoplastos de linhagens GAL 4G FP após fatos. A análise por microscopia confocal de varredura a laser indica o isolamento de protoplastos GFP positivos a partir de uma linhagem representativa GAL 4G FP. O RNA pode ser extraído dos protoplastos isolados, e um mililitro fornece quantidade suficiente de RNAA para detecção por fluoroespectrometria. Acabamos de mostrar como isolar protoplastos foliares de atopia ANA para triagem celular assistida por fluorescência e análise de expressão gênica específica por tipo celular.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular os protoplastos com cuidado e limitar sua exposição à luz. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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