Name: Ensaio Metástase Experimental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de metástase experimental para avaliar potencial metastático de células cancerígenas humanas usando injeções na veia da cauda em camundongos imunodeficientes. Este método permite quantificar metástases pulmonares.

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Este protocolo foi testado e otimizado inicialmente no laboratório do Dr. Richard Hynes (MIT). Financiamento é assegurado pelo Prêmio IDEA NYSTEM (para LX) e Ruth L. Kirschstein Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (para LX).

1. Preparação da Amostra <ol><li> Cultivar células confluentes para ~ 70% em seus meios específicos, com fatores de crescimento ou FBS (por exemplo, DMEM com SFB 10% para MC-1 células). Aspirar a mídia da placa e lavar cuidadosamente várias vezes com um x PBS (8 g / L de NaCl, 0,2 g / L de KCl, 1,15 g / L de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / L de KH 2 PO 4, pH 7,3). </li><li> Aspirar PBS e adicionar 2 ml de tripsina 0,05% em versene (0,014 g / L de vermelho de fenol e 0,2 g / L de EDTA-Na em 1 x PBS, pH 7,2). Agite levemente placa para facilitar o desapego célula de prato. Observe as células sob um microscópio. Ele normalmente leva 2-5 minutos para as células de separar. </li><li> Adicionar um volume amplo de mídia contendo FBS (ou inibidor de tripsina de soja) para extinguir a atividade de tripsina e recolher as células em um tubo falcon 50ml. Contagem de células utilizando um hemocitômetro. Carga 10μL de suspensão de células em um hemocitômetro limpo. O número de células por ml é igual ao número médio de células em cada uma das cinco praças multiplicado por 10 4. </li><li> Centrifugar as células a 1000 RPM (ou ~ 200 xg) em uma centrífuga de bancada por 3 minutos. </li><li> Remova cuidadosamente os meios de comunicação, sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em um volume adequado de solução tampão de Hanks Balanced (HBSS) para alcançar uma concentração final de ~ 5 x 10 6 células / mL. </li><li> Células do filtro através de um filtro de células Falcon 70 mM para excluir agregados de grandes células. Coloque a ponta da pipeta directamente para o filtro ao longo de um tubo de cultura rotulados 5mL Falcon. Rapidamente ejetar a suspensão através do filtro dentro do tubo de cultura. </li><li> Contagem de células novamente usando um hemocitômetro e diluí-los para uma concentração final de 2,5 x 10 6 / mL. Manter as células no gelo. </li><li> Determinar a viabilidade das células. Mix algumas células com azul de tripano e medir a percentagem de mortos (azul), as células sobre as células totais utilizando um hemocitômetro. A viabilidade das células deve ser ≥ 90% antes da injeção. </li></ol> 2. Injeção intravenosa <ol><li> Mudar de luvas. Agarram delicadamente a cauda de um rato imunodeficientes (nude, NOD SCID, ou NSG, Laboratório de Jackson) e puxe-o para o limitador mouse, com suas costas contra a fenda e sua cauda de fora da pequena abertura na parte de trás do limitador . </li><li> Lentamente, deslize o anel para dentro ao longo da fenda e fixá-la no lugar uma vez o anel de trava a boca do mouse. O rato não deve ser capaz de mover-se livremente, mas deve ter ritmo normal da respiração. </li><li> Encontrar as veias da cauda grande. Quatro vasos sanguíneos principais estão presentes em um rabo de rato. Vasos sangüíneos nos lados dorsal e ventral da cauda são artérias. Veias são nas laterais da cauda. </li><li> Desenhe mais de 200 mL das células preparadas para uma seringa de 1ml. Coloque a agulha 30 G1 / 2 polegada e empurrar para fora as bolhas de ar que possam existir. O volume final de células na seringa deve ser de 200 mL (ou seja, 5 x 10 5 células no total). </li><li> Injetar células dentro da veia. <ol class="lalpha"><li> Começar a partir da extremidade distal da cauda, ​​por isso, se o primeiro teste falhar, uma região mais proximal da cauda poderia ser usado para uma segunda tentativa. </li><li> Limpe o rabo com etanol 70%. Puxar o rabo reto. Segure a ponta da cauda com o polegar e apoiar o ponto de injeção com o dedo indicador. </li><li> Inserir a agulha na veia e injetar células. Certifique-se a agulha ea seringa são paralelas à veia durante a injeção, caso contrário, a agulha vai picar através da parede do vaso e injetar as células nos tecidos adjacentes cauda. </li><li> Retirar a agulha após a injecção. Sangue deve profusa no local da injecção, se a injeção foi com sucesso. Pressione uma parte limpa da toalha de papel ou chumaço de algodão no local da injecção a fim de facilitar a coagulação e apalpar o rabo para cima para empurrar qualquer amostra residual na veia em circulação. </li><li> Solte o mouse do limitador e devolvê-lo para a jaula. Registrar o processo de injeção (por exemplo, quantos ensaios que levou para injetar as células e quanto células foram injetadas), em um caderno de anotações. </li><li> Determinar a viabilidade das células após a injeção, como descrito na Seção de Preparação da Amostra, a Etapa 9. Esta etapa fornece garantia de que as células se manter vivo durante todo o processo de injeção. No final de um experimento de injeção, a viabilidade das células irá diminuir, mas deve ser acima de 80%. </li><li> (Opcional) Gire para baixo as células sobras e lavar as pelotas com PBS uma vez. Congelar a pellets a -80 oC para análises futuras (por exemplo, western blots para confirmar a expressão do gene ou knockdowns). </li></ol></li><li> Geralmente após um ou dois meses, os ratos serão dissecados e os locais de metástases são grosseiramente determinados. De pulmão é o principal local de metástase, uma vez que contém a primeira cama que as células capilares encontro depois que elesentrar na circulação. </li><li> Após lavagem com PBS, cada lóbulo do pulmão (ou outros tecidos que contêm metástases) é observada sob um microscópio de dissecação (Figura 1). O número de metástases detectáveis ​​em ambos os lados do pulmão é contada e os números de metástases pulmonares em todos os quatro lobos são somados como o número total de metástases pulmonares 1. Metástases de pulmão são mais facilmente detectado se os pulmões estão fixados em formol durante a noite , uma vez que as metástases se como manchas esbranquiçadas apppear em contraste com os tecidos adjacentes pulmão marrom escuro. </li></ol> 3. A cultura de células de metástases pulmonares <ol><li> Metástases pulmonares são isolados de camundongos injetados. Cada um deve ser cultivado separadamente. </li><li> Cada metástase é picada até o final de uma ponta de agulha (estéril) em um filtro de células 70 mM. </li><li> Lavar o filtro de células com vários mls de médio e células coletadas que passam através do filtro em um prato de cultura. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante pelo menos quatro dias sem perturbação. </li><li> Lavar sangue ou restos de tecido sobre o prato com PBS. </li><li> Adicionar meio fresco. No início, tanto as células cancerosas e células de fibroblastos crescer nas placas, mas, gradualmente, as células fibroblasto vai morrer e ser substituído por células cancerosas. Se as células cancerosas transportar qualquer genes resistentes aos medicamentos, selecione as células com antibióticos correspondente. </li><li> A pureza das células derivada é avaliada por imunomarcação utilizando anticorpos humanos contra proteínas específicas. Usamos um anti-anticorpo humano vimentina (VIM-NCL-V9, Novocastra). As células que contêm derivados em geral mais de 99% de células humanas, mesmo na ausência de seleção de medicamentos. As células recém-derivados pode ser injetado em camundongos imunodeficientes novamente para testar suas habilidades metastático, como descrito acima. </li></ol> 4. Resultados representante <ol><li> No final deste ensaio, uma linhagem de células altamente metastáticas de câncer geralmente dá origem a metástases pulmonares muitos (Figura 1), 1 enquanto metástases pulmonares muito poucos virão de uma linha mal câncer metastático de células. </li><li> As células derivadas usando este método costuma dar origem a metástases mais do que a linha dos pais, quando são testados novamente com este ensaio. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Imagens representativas dos pulmões do rato após injeções veia da cauda das células cancerosas. 5 x 10 5 da linha celular humana melanoma metastático, as células SM, 4 foram injetados na veia da cauda de camundongos imunodeficientes. Dois meses depois, os pulmões foram isolados e as metástases foram encontrados dispersos entre o tecido pulmonar normal.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

Metástase é a principal causa de morte em pacientes com câncer. Trata-se de quatro etapas principais: separação de células de câncer de seus loci primários, sua entrada em circulação (intravasation), sua saída de circulação (extravasamento), e sobrevivência e crescimento em um órgão distante. Metástase em humanos é considerada um processo lento e muitas vezes se manifesta após anos de latência. Para estudar a sua progressão em tempo hábil, o ensaio relativamente rápido acima experimental foi estabelecida em ratos imunod...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Fenol vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2,5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultrapuro</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Peneira celular Falcon de 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultura Falcon de 5 ml</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de calibre 30 &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Restritor para camundongo</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Microsscópio de dissecação</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio metástase experimental

Experimental Metastasis Assay

Metástase é a principal causa de morte em pacientes com câncer. Para entender o mecanismo de metástases, um ensaio de metástase experimental foi estabelecida usando camundongos imunodeficientes. Este artigo delineia os procedimentos envolvidos neste ensaio, incluindo a preparação da amostra, injeção intravenosa, e a cultura de células de metástases pulmonares. Resumidamente, um número pré-determinado de células humanas de câncer foram preparados<em&gt; In vitro</em&gt; E injetado diretamente na circulação de camundongos imunodeficientes através das veias sua cauda. Um pequeno número de células sobreviver à turbulência na circulação e crescer como metástases em órgãos internos, como pulmão. Os ratos injetados são dissecados após um certo período. A distribuição do tecido de metástases é determinada sob um microscópio de dissecação. O número de metástases em um determinado tecido é contado e que se correlaciona diretamente com a capacidade metastática das células cancerosas injetadas. As metástases surgido são isoladas e cultivadas<em&gt; In vitro</em&gt; Como linhas celulares, que freqüentemente mostram maior capacidade metastática do que a linha dos pais quando injetado novamente em camundongos imunodeficientes. Esses derivativos altamente metastáticas se tornar ferramentas úteis para a identificação de genes ou as vias moleculares que regulam a progressão metastática.

Este artigo descreve os procedimentos de um ensaio de metástase experimental que é usado para determinar o potencial metastático de linhagens de células humanas de câncer.

Ensaio Metástase Experimental

A metástase é a principal causa de morte em pacientes com câncer. Para compreender o mecanismo da metástase, foi estabelecido um ensaio experimental de metástase...

O objetivo geral do experimento a seguir é testar as capacidades metastáticas de células cancerígenas humanas por meio de injeções na veia caudal. Em camundongos imunodeficientes, as células são preparadas para injeção. Em seguida, as células são injetadas em camundongos imunodeficientes, que desenvolverão metástases pulmonares após um a dois meses.Os camundongos são dissecados e as metástases pulmonares são quantificadas e cultivadas. Os resultados desse tipo de ensaio indicam o grau de metástase de um tipo específico de célula cancerígena. Olá, sou Sonali Mohanty do laboratório da Dra. LE, do Departamento de Genética Biomédica da Universidade de Rochester.Hoje vamos mostrar um procedimento para realizar o ensaio de metástase experimental. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a metástase do câncer. Então, vamos começar.Inicie com células cultivadas até cerca de 70% de confluência; aspire o meio do recipiente e lave suavemente uma vez com um XPBS. Em seguida, adicione dois mililitros de tripsina 0,05% inversando. Agite suavemente o recipiente para facilitar a dessanexação celular.Observe as células ao microscópio enquanto elas se destacam. Adicione um volume generoso de meio contendo soro bovino fetal para inativar a tripsina. Em seguida, transfira para um tubo de 50 mililitros.Conte as células utilizando um hemocitômetro. Uma vez determinada a concentração, centrifugue a aproximadamente 200 vezes a gravidade durante três minutos sem perturbar o pellet celular. Remova cuidadosamente o meio e ressuspenda em um volume apropriado de solução tampão equilibrada de Hank ou HBSS para atingir uma concentração final de cerca de cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro.Em seguida, filtre através de um filtro celular de 70 micrômetros Falcon. Para excluir agregados celulares grandes, posicione a ponta da pipeta diretamente sobre o filtro, colocado sobre um tubo de cultura de cinco mililitros. Ejetar rapidamente a suspensão através do filtro para dentro do tubo.Conte novamente as células usando tripano azul para determinar a viabilidade. A viabilidade deve ser maior que 90% antes da injeção. Em seguida, dilua até uma concentração final de 2,5 vezes 10⁶ células por mililitro.Mantenha em gelo. Segure suavemente a cauda de um camundongo imunodeficiente e puxe-o para dentro do dispositivo de contenção, com as costas contra a fenda e a cauda saindo pela abertura traseira. Deslize lentamente o anel para dentro ao longo da fenda.Uma vez que o anel prenda a boca do camundongo, fixe-o no lugar. O camundongo não deve ser capaz de se mover livremente, mas deve manter uma taxa normal de respiração. Localize as veias principais da cauda.Quatro vasos sanguíneos principais estão presentes na cauda de um camundongo. As artérias estão localizadas nos lados dorsal e ventral da cauda. As veias estão localizadas nos lados laterais.Aspire pelo menos 200 microlitros das células preparadas para dentro de uma seringa de um mililitro. Acople uma agulha fina de 30 graus e elimine todas as bolhas de ar. O volume final na seringa deve ser de 200 microlitros.Prepare-se para injetar na extremidade distal da cauda. Assim, se a primeira tentativa falhar, uma região mais próxima da cauda poderá ser usada para uma segunda tentativa. Após limpar o local da injeção com etanol 70%, puxe a cauda para esticá-la.Segure a ponta com o polegar e apoie a ponta para injeção com o indicador. Insira a agulha na veia e injete as células. Certifique-se de que a agulha e a seringa estejam paralelas à veia durante a injeção.Caso contrário, a agulha perfurará a parede do vaso e as células serão injetadas nos tecidos adjacentes da cauda. Retire a agulha se o procedimento for bem-sucedido. O sangue deve perfundir a partir do local da injeção.Pressione uma bola de algodão limpa para facilitar a passagem do fio dental e palpe a cauda para cima para empurrar qualquer amostra residual para a circulação. Solte o camundongo do dispositivo de contenção e devolva-o à gaiola. Registre o número de tentativas de injeção e o número de células injetadas em um caderno de laboratório.Determine a viabilidade das células após a injeção. Como antes, esta etapa fornece a garantia de que as células permanecem vivas durante todo o processo de injeção. Ao final de um experimento de injeção, a viabilidade das células diminuirá, mas deve permanecer acima de 80%. Como etapa opcional, centrifugue as células remanescentes e lave os pellets com PBS uma vez.Em seguida, congele os pellets a menos 80 graus Celsius para análises futuras, como western blotting. Para confirmar a expressão gênica após silenciamento, após um a dois meses, dissecar os camundongos para determinar os locais das metástases. Inicie colocando o camundongo eutanasiado em uma estação de dissecação.Pulverize o camundongo abundantemente com etanol. Corte a caixa torácica para expor os pulmões e o coração. Em seguida, remova-os cuidadosamente e coloque-os em PBS.O pulmão é o local primário para metástase, pois contém o primeiro leito capilar que as células encontram. Após entrarem na circulação, remova o coração e lave os pulmões em PBS, depois observe cada lobo do pulmão sob um microscópio estereoscópico. Conte o número de metástases detectáveis em ambos os lados do pulmão e some os números de metástases pulmonares nos quatro lobos para determinar o número total de metástases pulmonares.Em seguida, isole metástases pulmonares individuais por excisão usando tesoura. Transfira cada metástase para um filtro celular de 70 micrômetros e pique-a usando a extremidade de uma tampa estéril de agulha. Enxágue o filtro celular com vários mililitros de meio e colete as células que passam através do filtro.Em uma placa de cultura, cada placa contém células de uma metástase. Incube as células a 37 graus Celsius por pelo menos quatro dias sem perturbação. Inicialmente, tanto as células cancerígenas quanto as células fibroblásticas crescerão nas placas, mas gradualmente as células fibroblásticas desaparecerão e serão substituídas por células cancerígenas.Se as células cancerígenas portarem genes resistentes a medicamentos, selecione as células com os antibióticos correspondentes. Após três dias, remova com lavagem qualquer sangue ou detritos teciduais, detritos no recipiente com PBS e adicione meio fresco. Avalie a pureza das células derivadas por imunomarcação com anticorpos contra proteínas específicas humanas aqui, sendo utilizado anticorpo anti-humano mesmo na ausência de seleção medicamentosa. Mais de 99% das células devem ser humanas.As células recém-derivadas podem agora ser injetadas novamente em camundongos imunodeficientes para testar suas capacidades metastáticas ao final deste ensaio. Uma linhagem celular de câncer altamente metastática normalmente dá origem a muitas metástases pulmonares, enquanto muito poucas metástases pulmonares surgirão de uma linhagem celular de câncer pouco metastática. Essas imagens mostram metástases pulmonares dois meses após a injeção da linhagem celular de melanoma humano.Um 3 7 5 sm. As células derivadas usando este método geralmente apresentam maior metástase do que a linhagem parental quando testadas. Novamente utilizando este ensaio, acabamos de mostrar a você o procedimento para realizar o ensaio de metástase experimental.Ao realizar este procedimento, é muito importante lembrar-se de garantir que as células sejam injetadas na veia da cauda, e não no intestino ou no tecido da cauda. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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