Ensaio Metástase Experimental

O objetivo geral do experimento a seguir é testar as habilidades metastáticas de células cancerígenas humanas por injeções na veia da cauda. Em camundongos imunodeficientes, as células são preparadas para injeção. As células são então injetadas em camundongos imunodeficientes, que gerarão metástases pulmonares após um a dois meses.

Os camundongos são dissecados e as metástases pulmonares são quantificadas e cultivadas. Os resultados desse tipo de ensaio indicam a extensão das metástases de um determinado tipo de célula cancerígena. Olá, sou Sonali Mohanty, do Laboratório do Dr.LE no Departamento de Genética Biomédica da Universidade de Rochester.

Hoje mostraremos um procedimento para realizar o ensaio experimental de metástase. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar metástases de câncer. Então vamos começar.

Comece com células crescidas até cerca de 70% de fluidez de Co, aspire o meio da placa e lave suavemente uma vez com um XPBS. Em seguida, adicione dois mililitros de 0,05% de tripsina invertida. Balance suavemente a placa para facilitar o descolamento celular.

Observe as células ao microscópio à medida que elas se desprendem. Adicione um amplo volume de mídia contendo FBS para saciar as viagens em atividade. Em seguida, transfira para um tubo de 50 mililitros.

Conte as células usando um hemocitômetro. Uma vez determinada a concentração, centrifugar a cerca de 200 vezes a gravidade durante três minutos sem perturbar o sedimento da célula. Remova cuidadosamente o meio Resus suspendendo um volume apropriado de solução tampão de equilíbrio de Hank ou HBSS para atingir uma concentração final de cerca de cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Em seguida, filtre através de um filtro de células de 70 micrômetros do Falcon. Para excluir agregados de células grandes, coloque a ponta da pipeta diretamente no filtro, colocado sobre um tubo de cultura de cinco mililitros. Ejete rapidamente a suspensão através do filtro para o tubo.

Conte as células novamente usando azul trian para determinar a viabilidade. A viabilidade deve ser superior a 90% antes da injeção. Em seguida, dilua até uma concentração final de 2,5 vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Mantenha no gelo. Agarre suavemente a cauda de um camundongo imunodeficiente e puxe-o para dentro do limitador de camundongos com as costas contra a fenda e a cauda saindo da pequena abertura nas costas. Deslize lentamente o anel para dentro ao longo da fenda.

Assim que o anel pegar a boca do mouse, trave-o no lugar. O mouse não deve ser capaz de se mover livremente, mas deve ter uma taxa normal de respiração. Encontre as principais veias da cauda.

Quatro vasos sanguíneos principais estão presentes na cauda do rato. As artérias estão localizadas nos lados dorsal e ventral da cauda. As veias estão localizadas nas laterais

Aspire pelo menos 200 microlitros das células preparadas em uma seringa de um mililitro. Prenda uma meia agulha de calibre 30 e empurre para fora todas as bolhas de ar. O volume final na seringa deve ser de 200 microlitros.

Prepare-se para injetar na extremidade distal da cauda. Portanto, se a primeira tentativa falhar, uma região mais proximal da cauda pode ser usada para uma segunda tentativa. Depois de limpar o local da injeção com 70% de etanol, puxe a cauda para trás.

Segure a ponta com o polegar e apoie a ponta injetável com o dedo indicador. Insira a agulha na veia e injete as células. Certifique-se de que a agulha e a seringa estejam paralelas à veia durante a injeção.

Caso contrário, a agulha perfurará a parede do vaso e as células serão injetadas nos tecidos adjacentes da cauda. Retire a agulha se o procedimento for bem-sucedido. O sangue deve se fundir do local da injeção.

Pressione uma bola de algodão limpa para facilitar o uso do fio dental e palpe a cauda para cima para colocar qualquer amostra residual em circulação. Solte o mouse do limitador e retorne-o à gaiola. Registre o número de tentativas de injeção e o número de células injetadas em um caderno de laboratório.

Determine a viabilidade das células após a injeção. Como antes, esta etapa fornece garantia de que as células permanecem vivas durante todo o processo de injeção. No final de um experimento de injeção, a viabilidade das células diminuirá, mas deve permanecer acima de 80%Como etapa opcional, gire as células restantes e enxágue os pellets com PBS uma vez.

Em seguida, congele os pellets a menos 80 graus Celsius para análises futuras, como western blotting. Para confirmar a expressão gênica em knockdowns Após um a dois meses, disseque os camundongos para determinar a localização das metástases. Comece colocando o camundongo sacrificado em uma estação de dissecação.

Pulverize o camundongo generosamente com etanol. Abra a caixa torácica para expor os pulmões e o coração. Em seguida, excise-os cuidadosamente e coloque-os no PBS.

O pulmão é o principal local de metástase, pois contém o primeiro leito capilar que as células encontram. Depois que eles entrarem na circulação, remova o coração e enxágue os pulmões em PBS e, em seguida, observe cada lobo do pulmão sob um microscópio de dissecação. Conte o número de metástases detectáveis em ambos os lados do pulmão e, em seguida, o número de metástases pulmonares em todos os quatro lobos juntos para determinar o número total de metástases pulmonares.

Em seguida, isole as metástases pulmonares individuais por excisão usando uma tesoura. Transfira cada metástase para um filtro de células de 70 micrômetros e pique-o usando a ponta de uma tampa de agulha estéril. Enxágue o filtro de células com vários mililitros de meio e colete as células que passam pelo filtro.

Em uma placa de cultura, cada placa contém as células de uma metástase. Incube as células a 37 graus Celsius por pelo menos quatro dias sem perturbação. Inicialmente, tanto as células cancerígenas quanto as células de fibroblastos crescerão nas placas, mas gradualmente as células de fibroblastos morrerão e serão substituídas por células cancerígenas.

Se as células cancerígenas carregam algum gene resistente a medicamentos, selecione as células com antibióticos correspondentes Após três dias, lave qualquer sangue ou detritos de tecido, detritos no prato com PBS e adicione meio fresco. Avalie a pureza das células derivadas por imunocoloração com anticorpos contra proteínas humanas específicas aqui e o anticorpo menting anti-humano é usado mesmo na ausência de seleção de medicamentos. Mais de 99% das células devem ser humanas.

As células recém-derivadas agora podem ser injetadas novamente em camundongos imunodeficientes para testar suas habilidades metastáticas no final deste ensaio. Uma linhagem de células cancerígenas altamente metastáticas normalmente dá origem a muitas metástases pulmonares, enquanto muito poucas metástases pulmonares virão de uma linhagem de células cancerígenas pouco metastáticas. Essas imagens mostram metástases pulmonares dois meses após a injeção da linha celular de melanoma humano.

Um 3 7 5 sm. As células derivadas usando esse método geralmente dão origem a mais metástases do que a linha parental quando são testadas. Novamente usando este ensaio, acabamos de mostrar o procedimento para realizar o ensaio experimental de metástase.

Ao fazer este procedimento, é muito importante lembrar de garantir que as células sejam injetadas na veia da cauda, mas não no tecido da cauda. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.