Crônico Salmonella Modelo de camundongos infectados

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo de camundongo cronicamente infectado por salmonela. Isso é realizado primeiramente preparando uma solução de salmonela. O segundo passo do procedimento é administrar, por gavagem, estreptomicina em camundongos, seguida de salmonela, ou apenas estreptomicina.

O terceiro passo do procedimento é isolar a salmonela a partir da matéria fecal de camundongos e detectar a infecção por salmonela no intestino de camundongos utilizando placas cromogênicas BL. O passo final do procedimento é observar e registrar a massa corporal dos camundongos e anotar as alterações na vitalidade após a infecção por salmonela. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram que uma infecção por salmonela pode ser estabelecida no intestino de camundongos gavados com salmonela.

Olá, sou Michelle P do laboratório do Dr. Johnson do Departamento de Medicina da Universidade de Rochester. Também sou do Laboratório Sun e sou Y do Laboratório Sun. Hoje vamos mostrar um procedimento para estabelecer um modelo de massa infectada por Alytic Lennar.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a transdução de sinais na interação entre hospedeiro e bactérias e na gênese tumoral. Vamos começar. Antes da experimentação, prepare placas de ágar Luria-Bertani (LB) suficientes para cada linhagem de Salmonella e para uso durante todo o experimento.

As placas podem ser refrigeradas e armazenadas por vários meses. Em seguida, prepare o cultivo de salmonela. Retire um frasco de estoque de salmonela congelado a menos 80 graus Celsius e deixe descongelar sobre a bancada para semear a chama de salmonela.

Coloque um alça de inoculação em um bico de Bunsen e mergulhe no estoque bacteriano descongelado. Faça movimentos em zigue-zague com a alça de um lado para o outro no terço superior da placa de LB. Flame a alça novamente e gire a placa.

Faça um movimento em zigue-zague com a alça para cruzar as estrias anteriores e espalhar as bactérias sobre o segundo terço da placa. Repita mais uma vez. Flame a alça novamente.

Não permita que o alça penetre no ágar. Deixe as colônias crescerem mantendo as placas em uma estufa a 37 graus Celsius durante a noite. Se realizado corretamente, a placa de salmonela deve apresentar colônias individuais em pelo menos uma seção.

No dia seguinte, escolha uma colônia da placa de LB utilizando um palito estéril ou alça bacteriológica e transfira para sete mililitros de LB em um tubo de 12 mililitros. Agite o tubo a 37 graus Celsius por cerca de cinco horas.

Use 0,05 mililitros dessa cultura para inoculação. Incube 50 mililitros de LB em um tubo Falcon a 37 graus Celsius, sem agitação, por aproximadamente 18 horas.

Centrifugue a cultura bacteriana de 50 mililitros cultivada durante a noite, à temperatura ambiente, a 5.000 RPM por 10 minutos e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 1,5 mililitro de solução salina tamponada com Hank ou HBSS ao tubo para ressuspender as bactérias, na proporção de 100 partes de LB para três partes de HBSS. Depois, complete o volume total para 15 mililitros com HBSS ou numa proporção de um para 10 de LB para HBSS.

Cada camundongo requer 100 microlitros de cultura diluída de salmonela, ou entre um vezes 10 à sexta e um vezes 10 à oitava unidades formadoras de colônia, antes do início da retirada de água e alimento dos camundongos quatro horas antes do experimento. Em seguida, prepare imediatamente uma solução de estreptomicina antes da gavagem, diluindo 7,5 miligramas de estreptomicina em pó em 100 microlitros de HBSS. Para cada camundongo injetado, certifique-se de preparar um volume extra para compensar perdas antes da gavagem dos camundongos.

Primeiro, prepare uma agulha de alimentação com 100 microlitros de solução de estreptomicina. Retire o primeiro camundongo da gaiola para receber a gavagem e segure o camundongo voltado para a superfície da bancada. Segure firmemente a pele sobre o ombro do camundongo com o polegar e o dedo médio, esticando a cabeça e o pescoço com o dedo indicador para alinhar o esôfago.

Direcione a ponta esférica da agulha de alimentação ao longo do palato e em direção ao lado direito da parte posterior da faringe. Em seguida, passe-a suavemente para dentro do esôfago e injete os 100 microlitros de solução de estreptomicina. Nenhuma resistência deve ser sentida.

Repita este processo para todos os camundongos experimentais e controles submetidos ao experimento. Após aproximadamente 20 horas seguintes à strp de m e à gavagem e quatro horas antes da gavagem com salmonela, retire a água e o alimento dos camundongos que receberão a gavagem com salmonela por via oral. Realize a gavagem em cada camundongo da mesma maneira que antes, utilizando 100 microlitros de solução de salmonela em HBSS.

Após a gavagem, transfira cada camundongo para uma nova gaiola para iniciar a coleta fecal. A partir de cerca de oito horas após a gavagem, remova imediatamente os excrementos da gaiola logo após a queda. Colete 100 miligramas de matéria fecal de camundongo como amostra experimental.

Colete amostras diariamente ou semanalmente, dependendo da duração do estudo, para análise de salmonela em matéria fecal. Transfira a amostra fecal para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com um mililitro de PBS e vortexie vigorosamente por 10 minutos a 800 RPM. Transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro limpo e centrifugue a 6.000 RPM por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e adicione 200 microlitros de PBS aos pellets, agitando em vórtex para ressuspender. Em seguida, detecte *Salmonella* com uma placa de aglutinação BB l. Utilize de 10 a 100 microlitros de solução de material fecal por placa, espalhando na placa conforme mostrado na seção dois.

As espécies de salmonela apresentam coloração mar devido a diferenças metabólicas na presença de cromógenos selecionados. Conte as colônias de salmonela na placa para comparar o nível de infecção entre camundongos individuais. Neste procedimento experimental, utilizamos camundongas fêmeas livres de patógenos específicos da linhagem C 57 black six, com seis a sete semanas de idade.

Os camundongos foram infectados com salmonela e estreptomicina mais HBSS. Os camundongos foram controlados por gavagem com estreptomicina apenas. As cepas de salmonela utilizadas incluem a cepa selvagem de Salmonella typhimurium, ATCC 1 4 0 2 8 S FP C, uma cepa mutante não patogênica de salmonela e três cepas FPC do laboratório do Dr. James Madera portando o gene AAV R age associado à virulência no plasmídeo de baixa cópia PSKW 29. Utilizando este protocolo, a colonização por Salmonella typhimurium pode ser detectada no intestino do camundongo.

A infecção crônica por salmonela foi medida pela análise de matéria fecal e foram coletadas amostras de peso corporal e de tecido intestinal para coloração por imunofluorescência. Normalmente, ocorre perda de peso corporal e morte dentro de quatro semanas após a infecção. As proporções de sobrevivência quatro semanas após a infecção são mostradas aqui.

Uma vez que os camundongos sobrevivem quatro semanas após a infecção, eles ganham peso corporal e a incidência de morte diminui nas 23 semanas restantes. No geral, mais de 65% dos camundongos infectados com cepas de salmonela, FSY fsy, A VRA nula ou fsy. A VRA heterozigota conseguem sobreviver por mais de seis meses com infecção persistente de salmonela no intestino.

Após a infecção aguda, os sobreviventes ainda carregavam salmonela, que pôde ser detectada seis meses após a infecção utilizando o método descrito neste protocolo. A análise de imunofluorescência de amostras de tecido do intestino de camundongo mostra a invasão da salmonela na mucosa intestinal em 27 semanas após a infecção. Nesta imagem, os núcleos são corados em azul e as células infectadas por salmonela são mostradas em verde.

Como mostrado no grupo controle, não há coloração verde brilhante, o que indica ausência de colonização por salmonela. Já em camundongos infectados com salmonela aos 27 semanas após a infecção, observa-se coloração verde brilhante na mucosa intestinal. Isso demonstra a persistência da infecção por salmonela no camundongo pré-tratado com estreptomicina.

Acabamos de mostrar como induzir infecção crônica em alguns modelos de camundongo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar um cultivo fresco para a infecção, aplicar corretamente as técnicas de infecção e detectar a presença de ANA para garantir que o seu modelo experimental esteja funcionando. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.