Name: Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Aprenda a selecionar aptâmeros de RNA que se ligam à proteína β-amilóide usando métodos de evolução in vitro. Esta técnica robusta oferece ferramentas promissoras para diagnóstico e terapia da doença de Alzheimer.

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Este trabalho foi suportado por concessões de NIH AG030709 / NIA e 07-65798 do Departamento de Saúde Pública da Califórnia. Reconhecemos Margaret M. Condron para peptídeo síntese e análise de aminoácidos, Dr. Elizabeth Neufeld F. para ajudar e apoiar os passos iniciais do projeto, Dr. Chi-Hong B. Chen para dar suporte e reagentes, e André, Dr. D . Ellington para discussões úteis.

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<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
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<li>Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heregulin+signaling+by+an+aptamer+that+preferentially+binds+to+the+oligomeric+form+of+human+epidermal+growth+factor+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).</li>
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<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ponto de partida do processo SELEX é a síntese de uma biblioteca de oligonucleotídeos aleatórios tipicamente contendo 10 12 -10 15 seqüências. No DNA SELEX, esta biblioteca é usada diretamente depois de um pool de ssDNA é gerada, enquanto que no RNA SELEX, demonstrado aqui, a biblioteca ssDNA é convertido primeiro a um pool de RNA enzimaticamente por in-vitro de transcrição. Então, é realizada iterativamente SELEX que cada ciclo compõe a exposição e ligação de oligonucleotídeos para o al...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>UCLA Biopolymers Laboratory</td><td></td><td>Pó liofilizado</td></tr><tr><td>Microbalança Automatizada MX5</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,6 ml revestidos com silicone</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 ou C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utilizar em capela de exaustão.</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Vortex até a solução ficar límpida. O APS é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)diclororutênio(II) hexaidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Vortex até a solução ficar límpida. Cubra o tubo de RuBpy com papel alumínio para proteger o reagente da luz ambiente. O RuBpy é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Colunas desaladoras D-Salt&amp;#8482; Excellulose&amp;#8482;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 0,6 ml revestidos com silicone</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Géis Novex Tricine (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10 poços; tamanho mini (8 cm X 8 cm); volume de carga de 25 &amp;#x03BC;l por poço; faixa de separação de 5 kDa a 40 kDa</td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Beckman DU 640</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Encomendado sob medida</td><td>A biblioteca foi projetada para conter 49 nucleotídeos aleatórios flanqueados por duas regiões constantes contendo sítios de ligação de iniciadores e clonagem: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Polimerase Taq de DNA</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>Polimerase de DNA recombinante &lt;em&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; fornecida com tampão PCR 10&amp;#215; e um tubo separado de MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 25 mM para PCR rotineira.</td></tr><tr><td>Mistura de nucleotídeos para PCR, solução 10 mM</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(10 mM cada de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>Primer direto</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Encomendado sob medida</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Primer reverso</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Encomendado sob medida</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Ciclador térmico</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAquick de Purificação de PCR (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônico estéreis de 1,6 ml com tampas fixadas por anéis O</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema RiboMAX&amp;#8482; de Produção em Grande Escala de RNA&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>O kit contém: 120 &amp;#x03BC;l de Mistura Enzimática (polimerase de RNA, inibidor recombinante de ribonuclease RNasin&amp;#174; e pirofosfatase inorgânica recombinante); 240 &amp;#x03BC;l de tampão de transcrição 5×; 100 &amp;#x03BC;l de cada um dos 4 rNTPs, 100 mM; 110 U de DNase livre de RNase RQ1, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;l de DNA controle linear, 1 mg/ml; 1 ml de acetato de sódio 3M (pH 5,2); 1,25 ml de água livre de nucleases</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-citidina 5&amp;rsquo;-trifosfato, 250 &amp;mu;Ci (9,25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>Atividade específica: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricina (pH 7,6)</td></tr><tr><td>Fenol saturado com citrato:clorofórmio:álcool isoamílico (125:24:1, pH 4,7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto para biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada Z216-MK</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>Colunas Micro illustra ProbeQuant&amp;#8482; G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>Obtido da Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>Pré-embaladas com Sephadex&amp;#8482; G-50 grau DNA e pré-equilibradas em tampão STE contendo 0,15% de Kathon como biocida</td></tr><tr><td>Contador de cintilação de bancada Triathler</td><td>Hidex Oy, Turku, Finlândia</td><td>Modelo Triathler LSC: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Tampão amostral Novex&amp;#174; TBE-Ureia (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Géis 6% TBE-Ureia, 1,0 mm, 10 poços</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de corrida Novex&amp;#174; TBE (5&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>Descontaminante de radioatividade</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>Pontas para carregamento de géis</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>Célula Mini XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>Célula Mini XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Filme de autorradiografia</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>Utilizar em completa escuridão</td></tr><tr><td>Filme de autorradiografia, Hyperfilm&amp;#8482; ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>Pode ser usado sob luz vermelha segura.</td></tr><tr><td>Discos de membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>Membranas de ésteres de celulose mistos, hidrofílicas, 0,22-&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Base de suporte de vidro fritado para frasco de 125 ml</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol para biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor recombinante de RNase</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transcrição Reversa ImProm-II&amp;#8482;</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor recombinante de RNase</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carregamento RapidRun&amp;#8482;</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

seleção de aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de alzheimer

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Doença de Alzheimer (DA) é uma progressiva, dependente da idade desordem, neurodegenerativas com um curso insidioso que torna seu diagnóstico pré-sintomático difícil 1. AD diagnóstico definitivo é obtido post-mortem só, estabelecendo assim o diagnóstico, pré-sintomático precoce da AD é crucial para o desenvolvimento e administração de terapias eficazes 2,3. Β-amilóide-proteína (Aâ) é central para a patogênese AD. Solúvel, oligomérica assembléias Aâ Acredita-se que afetam a disfunção subjacente neurotoxicidade sináptica e perda de neurônios na AD 4,5. Várias formas de assembléias Aâ solúveis têm sido descritos, no entanto, suas inter-relações e relevância para a etiologia e patogenia AD são complexas e não bem compreendido 6. Ferramentas específicas de reconhecimento molecular pode desvendar as relações entre os conjuntos Aâ e facilitar a detecção e caracterização destes conjuntos no início do curso da doença antes que os sintomas surjam. Reconhecimento molecular comumente se baseia em anticorpos. No entanto, uma classe alternativa de ferramentas de reconhecimento molecular, aptâmeros, oferece vantagens importantes em relação aos anticorpos 7,8. Aptâmeros são oligonucleotides gerados por in-vitro de seleção: a evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) 9,10. SELEX é um processo iterativo que, semelhante à evolução darwinista, permite a amplificação de seleção, o enriquecimento, ea perpetuação de uma propriedade, por exemplo, ávido, específico, ligante de ligação (aptâmeros) ou atividade catalítica (ribozimas e DNAzymes). Apesar da emergência de aptâmeros como ferramentas em biotecnologia moderna e da medicina 11, eles têm sido subutilizados no campo amilóide. RNA poucos ou aptâmeros ssDNA foram selecionados contra diversas formas da proteína príon (PrP) 12-16. Um aptamer RNA recombinante contra gerada PrP bovina foi mostrado para reconhecer bovina PrP-β 17, um solúvel, oligomérica, β-folhas ricas variante conformacional de full-length PrP que forma fibrilas amilóides 18. Aptâmeros gerados usando formas monomérica e vários de β fibrilar 2-microglobulina (β 2 m) foram encontradas para ligar fibrilas de algumas outras proteínas amiloidogênicas além β 2 m fibrilas 19. Ylera et al. descrito aptâmeros RNA selecionada imobilizada contra monomérica Aβ40 20. Inesperadamente, esses aptâmeros ligado fibrilar Aβ40. Em conjunto, esses dados levantam várias questões importantes. Por que aptâmeros selecionados contra proteínas monoméricas reconhecer suas formas poliméricas? Poderia aptâmeros contra as formas monoméricas e / ou de proteínas oligoméricas amiloidogênicas ser obtido? Para responder a essas questões, buscou-se selecionar aptâmeros para covalentemente estabilizado oligomérica Aβ40 21 gerados usando foto-induzida cross-linking de proteínas não modificadas (picup) 22,23. Similar aos resultados anteriores 17,19,20, esses aptâmeros reagiu com fibrilas de Aâ e várias outras proteínas amiloidogênicas provável o reconhecimento de um amilóide potencialmente estrutural comum aptatope 21. Aqui, apresentamos a metodologia SELEX utilizados na produção destes aptâmeros 21.

Aptâmeros são ribo-/deoxyribo-oligonucleotides curtas selecionados por<em&gt; In-vitro</em&gt; Métodos de evolução com base na afinidade por um alvo específico. Aptâmeros são ferramentas de reconhecimento molecular com o versátil aplicações terapêuticas, de diagnóstico e pesquisa. Demonstramos métodos de selecção dos aptâmeros para a proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer.

Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo, dependente da idade, com um curso insidioso que torna o seu diagnóstico pré-sintomático...

O objetivo geral dos experimentos de seleção é selecionar moléculas de RNA que se liguem de forma específica e acentuada a uma proteína alvo em Seleções de RNA. Isso é alcançado pela transcrição in vitro de RNA a partir de uma biblioteca de oligonucleotídeos de DNA aleatórios, seguida pela incubação do pool de RNA transcrito com a proteína alvo. Como segundo passo, utiliza-se um filtro de ligação.Isso separa as moléculas de RNA de ligação ao alvo da população de RNA não ligado. Em seguida, as moléculas de RNA que ligam ao alvo são eluídas, transcritas reversamente para DNA, amplificadas por PCR e transcritas novamente para RNA.Esse pool de RNA, que agora está enriquecido por alguns aptâmeros ligantes, é utilizado para ligação ao alvo no próximo ciclo de seleção. Geralmente, após oito a 20 ciclos, são selecionados e caracterizados aptâmeros altamente específicos e com alta afinidade pelo alvo. Olá, sou Gal Bean do Departamento de Neurologia da UCLA hoje, Far Rahimi.Um pós-doutorando sênior do meu laboratório vai demonstrar um processo chamado cellex. Utilizamos esse processo no laboratório para selecionar abers para oligômeros de beta amilóide. Então, vamos começar.Para leitura, é tudo seu. Neste experimento selecionado, ligamentos proteicos estáveis livres de agregados homogêneos, compostos pela proteína amilóide beta A beta 40, são preparados utilizando o procedimento de coleta conforme descrito em um protocolo anterior em vídeo da Jove, com modificações detalhadas no protocolo escrito acompanhante. Após a reticulação, purifique a mistura de ligamentos reticulados utilizando colunas de dessalinização de cinco mililitros.Primeiro, coloque a coluna em um suporte com um béquer abaixo da saída da coluna. Remova a tampa superior da coluna e retire a rolha da saída. Deixe o tampão de armazenamento passar e colete-o no béquer.Em seguida, equilibre a coluna com cinco volumes da cama de resina em alíquotas de três mililitros de acetato de amônio 10 milimolar, pH 8,3. Após a equilibração da coluna, aplique uma alíquota de 0,5 mililitro da mistura da reação de captação à coluna. Deixe a mistura proteica penetrar na resina e descarte o fluxo inicial.No béquer, posicione o primeiro tubo de coleta abaixo da saída da coluna. Adicione 0,5 mililitros do tampão acetato à coluna e colete a primeira fração de 0,5 mililitro que escoa. Repita a eluição para coletar frações de 8,5 mililitros nos tubos correspondentes.As amostras são caracterizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e absorbância. Combine as frações com o maior teor proteico e misture suavemente usando uma pipeta, conforme descrito no protocolo escrito. Guarde uma alíquota de 10 microlitros para análise de aminoácidos e armazene o restante.Em seguida, prepare o pool de RNA. Comece amplificando a biblioteca de DNA simples fita sintético por PCR, conforme descrito no protocolo escrito anexo. Purifique o produto de DNA amplificado e verifique a quantidade de DNA por eletroforese em gel de agarose a 2%.Em geral, a concentração e o rendimento de DNA são de 160 mais ou menos 10 nanogramas por microlitro em 50 microlitros por tubo. Em seguida, transcreva o DNA in vitro na presença de CTP radioativo durante a noite, seguido pela digestão do molde de DNA amplificado por DNA durante quatro horas para gerar um pool de RNA marcado com P 32, conforme detalhado no protocolo escrito acompanhante. Embora o fabricante Promega recomende uma incubação de 15 minutos com DNA, descobrimos em nossos experimentos que uma incubação de quatro horas resulta na remoção completa de todo o molde de DNA após a incubação com d ns.Extraia o RNA adicionando um volume de fenol com cloreto de benzila saturado com citrato, clorofórmio e álcool isoamílico, vórtex por cerca de um minuto e centrifugue a 16.000 Gs por dois minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, transfira a fase aquosa superior para um tubo novo. Usando uma micropipeta, adicione um volume de clorofórmio e álcool isoamílico, vórtex por um minuto e centrifugue. Como antes, remova a fase inferior por aspiração usando uma micropipeta.Observe que, nesta etapa, é mais fácil remover a fase inferior do que a superior. A fase inferior é descartada como resíduo. Em seguida, precipite o RNA adicionando 0,1 volume equivalente de acetato de sódio 3 M e um volume equivalente de isopropanol.Misture e coloque no congelador a menos 20 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, centrifugue, aspire o sobrenadante e lave o pellet de RNA com 0,5 mililitros de etanol 70%. Após a lavagem com etanol, centrifugue novamente e descarte o etanol. Seque o pellet de RNA a 37 graus Celsius por cinco minutos em um bloco térmico e dissolva a amostra de RNA em tampão STE 150 milimolar pH 8,0 até um volume idêntico ao da reação de transcrição in vitro.Aqueça o tubo contendo o produto de RNA a 70 graus Celsius por 10 minutos em um bloco térmico e vortex. Para facilitar a dissolução do RNA, centrifugue na velocidade máxima por um minuto à temperatura ambiente, mantendo um microlitro de RNA Eloqua para contagem de cintilação e eletroforese em gel de poliacrilamida com ureia TPE. Após a dissolução do RNA, remova os nucleotídeos não incorporados utilizando colunas G 50, seguindo as instruções do fabricante.Lembre-se de reservar um microlitro do RNA purificado em G 50 para contagem em contador de cintilação e eletroforese em gel desnaturante. Utilize as duas alíquotas de um microlitro de RNA provenientes da precipitação do RNA e da etapa de dessalting em G 50 para a contagem em contador de cintilação. Calcule a porcentagem de incorporação do marcador após a contagem de cintilação e o cálculo da porcentagem de incorporação; em seguida, calcule o rendimento do RNA e a atividade específica do RNA.Finalmente, examine o RNA antes e depois da purificação em coluna G 50, submetendo as amostras a um gel de poliacrilamida 6% TBE com ureia e visualizando o RNA por auto-radiografia conforme descrito no protocolo escrito anexo. Se estiver satisfeito com a qualidade do produto marcado, prossiga misturando a biblioteca de RNA com a amostra proteica para seleções. Incube o estoque de RNA a 90 graus Celsius por 10 minutos para desnaturação e, em seguida, à temperatura ambiente por 10 minutos para renaturação lenta.Enquanto o RNA está em incubação, dissolva um tubo de proteína em oito microlitros de hidróxido de sódio 60 milimolar mais 36 microlitros de água desionizada livre de núcleos. Sonique a mistura por um minuto e adicione 36 microlitros de tampão de ligação de RNA 2X. Para o controle negativo.Combine o RNA com 20 microlitros de tampão de ligação 10 XRNA e complete o volume até 200 microlitros adicionando água livre de nucleases. Para a reação de ligação, combine 20 microlitros da mistura de proteína e RNA com 20 microlitros de tampão de ligação 10 XRNA e complete o volume até 200 microlitros com água livre de nucleases.Incube os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente. Enquanto as amostras estão incubando, prepare os filtros e a montagem para ligação ao filtro. Primeiro, conecte um frasco com saída lateral de 125 mililitros à entrada de vácuo. Coloque um suporte de vidro poroso pré-limpo para o filtro sobre o frasco com saída lateral.Em seguida, equilibre três membranas de filtro em dois a três mililitros de tampão de ligação 1XRNA em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros durante 10 a 15 minutos. Quando as amostras do controle negativo e das reações de ligação terminarem a incubação, centrifugue-as em velocidade máxima por cinco minutos. À temperatura ambiente, prossiga ligando o vácuo e coloque a primeira membrana sobre o vidro poroso, usando uma pipeta microlitera para aplicar gotas de 0,5 mililitros de tampão de ligação de RNA sobre a membrana.Ajuste o vácuo para permitir o escoamento lento de cada gota do tampão através da membrana. Este primeiro filtro é usado apenas para ajustar a sucção a vácuo. Em seguida, coloque a segunda membrana sobre o vidro poroso e, utilizando a mesma taxa de fluxo, aplique o controle negativo sobre a membrana.Após aplicar a amostra, lave-a quatro vezes com alíquotas de 0,5 mililitro de um tampão de ligação de RNA. Remova a membrana do controle negativo e coloque-a em um tubo para contagem por cintilação. Substitua o vidro poroso por um segundo suporte de vidro poroso pré-limpo.Coloque o terceiro disco sobre o vidro poroso e aplique a mistura da reação de ligação. Lave o filtro conforme acabou de ser demonstrado; o número de lavagens pode ser aumentado em ciclos de seleção posteriores. Para aumentar a rigidez das condições de seleção, remova o disco de filtro e coloque-o em um tubo de 1,6 mililitro identificado como reação de ligação.Realize a contagem por cintilação para ambos os filtros. Calcule o nível de radioatividade ligada ao filtro em comparação com a quantidade total de radioatividade aplicada às membranas. Isso fornece uma indicação do enriquecimento de ligação à medida que a seleção progride.Após a contagem por cintilação, remova o filtro da reação de ligação do tubo e coloque-o em uma placa de Petri limpa e seca de 35 por 10 milímetros. Usando um bisturi limpo e uma pinça, corte a membrana em pequenos pedaços. Use a pinça para transferir os pedaços cortados de volta ao frasco de cintilação.Adicione 400 microlitros de tampão de evolução e incube o tubo a 95 graus Celsius por 10 minutos. Ao final de 10 minutos, misture por vortex e centrifugue o tubo em velocidade máxima à temperatura ambiente, aspire e colete o tampão de extração em um novo tubo identificado. Meça as contagens de radioatividade remanescentes no tubo contendo os fragmentos de membrana por contagem de cintilação. Para avaliar a eficiência de extração, repita a extração três vezes; a eficiência após três extrações é geralmente de cerca de 95 a 96%. Em seguida, adicione três a quatro microlitros de glicogênio como co-precipitante de RNA e extraia e precipite o RNA liberado do filtro conforme demonstrado anteriormente, exceto por colocar no congelador a menos 20 graus Celsius durante a noite.Após a incubação durante a noite, centrifugue a amostra; o RNA precipita em uma fase líquida que é quase imperceptível. Aspire o sobrenadante cuidadosamente sem deslocar essa fase precipitada quase invisível no fundo do tubo. Lave o pellet de RNA com 0,5 mililitros de etanol 70%, centrifugue por cinco minutos em velocidade máxima a quatro graus Celsius e descarte o etanol por aspiração, sem deslocar a fase precipitada quase invisível.Resuspenda o pellet de RNA em 50 microlitros de tampão STE e prossiga para a purificação G 50 conforme descrito para o RNA recém-transcrito no protocolo escrito anexo. Para avançar para o próximo ciclo de seleções, realize a transcrição reversa do RNA para DNA seguida da amplificação por PCR conforme descrito no protocolo escrito anexo. Lembre-se de incluir uma amostra controle negativa sem a transcriptase reversa.Verifique os produtos da PCR em um gel se a marcação do controle negativo estiver vazia e as outras marcações estiverem como esperado. Prossiga para transcrever e rotular o RNA conforme mostrado anteriormente para uso. No próximo ciclo de seleção, escolha o oligomérico gerado na coleta.Uma proteína beta 40 utilizada aqui para seleções foi purificada conforme demonstrado neste protocolo em vídeo e depois analisada por meio de medidas de absorbância mostradas pelo traçado vermelho e eletroforese em gel de SDS. A proteína geralmente elui da coluna nas frações três a cinco, e o reagente de reticulação saluta após a fração seis, indicado pelo aumento da absorbância na fração sete. A eletroforese em gel de SDS mostra a distribuição típica de todos os ligantes beta 40.A integridade do RNA em cada ciclo de seleção é importante para a progressão iterativa dos experimentos de seleção. Após a transcrição e marcação do RNA, a qualidade do RNA marcado é avaliada por eletroforese em gel desnaturante. Abaixo há um perfil típico de um produto de RNA marcado íntegro antes e após a purificação em coluna G-50. O molde de DNA contaminante proveniente de ciclos de seleção anteriores, ainda presente após a reação de transcrição in vitro, pode reduzir a eficácia da seleção, exigindo mais ciclos.A eletroforese em gel dos produtos da reação de transcrição reversa seguida por amplificação PCR mostra o produto de DNA esperado. A ausência de produto de DNA nos tubos de reação controle negativo indica a remoção bem-sucedida do molde de DNA mediante o tratamento com DNAse após a transcrição in vitro. Ok, acabamos de mostrar como selecionar anticorpos para oligômeros de beta amilóide 40 estabilizados covalentemente por fotoconjugação. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que ambas as moléculas precisam ter uma estrutura estável para que tenham alta afinidade, bem como o fato de ambas possuírem uma estrutura tridimensional na qual interagem.Ok, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos uma técnica para a preparação de esclarecer humanos homogeneizados cortical, separação de proteínas por SDS-PAGE, recuperação antigênica e immunoblotting com um anticorpo para o peptídeo Aâ. Usando este protocolo, que consistentemente detectar Aâ monomérica e multimérica no tecido cortical dos seres humanos com a patologia de Alzheimer.

SDS-PAGE/Immunoblot Detecção de multímeros Aâ no tecido cortical Humanos homogeneizados utilizando antígeno Epitope-Retrieval

Usando microscopia de força atômica em combinação com a tecnologia de biopanning, criamos um sistema de biopanning negativo e positivo para adquirir anticorpos contra variantes proteicas específicas da doença presentes em qualquer material biológico, mesmo em baixas concentrações.  Obtivemos sucesso na obtenção de anticorpos para variantes da proteína TDP-43 envolvidas na Esclerose Lateral Amiotrófica.

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração.

Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável

Para estudar os efeitos de Aβo in vivo, desenvolvemos um modelo baseado em infusões repetidas de Aβo solúvel no hipocampo juntamente com infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) no hipocampo usando bombas osmóticas para neutralizar o efeito neurotóxico de Aβo.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

Aqui, relatamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza, capazes de formação de oligômeros. A beta-amiloide é um peptídeo hidrofóbico altamente propenso a agregação implicado na doença de Alzheimer. A natureza amiloidogênica do peptídeo torna sua purificação um desafio.

A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

Imagem molecular com laser assistida por matriz baseada em ionização/dessorção de imagem espectrometria de massa (MALDI-IMS) permite o mapeamento simultâneo de vários analitos em amostras biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e visualização da proteína β amiloide nos tecidos do cérebro de doença de Alzheimer e amostras de Angiopatia amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualização dos depósitos β amiloide no cérebro humano com Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de imagem espectrometria de massa

O presente protocolo descreve e compara o procedimento para realizar uma análise de interesse de região completa ou sub-região de seções cerebrais de camundongos sagitos para quantificar a carga amilóide-beta no modelo de camundongo transgênico APP/PS1 da doença de Alzheimer.

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Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

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Aqui, descrevemos um sistema de levedura reconstituindo a γ-secretase humana. Este sistema permite a identificação e o estudo de mutações que afetam a atividade e a triagem de inibidores da γ-secretase (GSIs). Utilizando as propriedades de perda de função dos mutantes familiares da doença de Alzheimer, é possível rastrear moduladores de γ-secretase (GSMs).

Saccharomyces cerevisiae Modelos da doença de Alzheimer para rastrear genes, mutações e produtos químicos que afetam a produção de beta-amilóide pela γ-secretase

Aprenda a selecionar aptâmeros de RNA que se ligam à proteína β-amilóide usando métodos de evolução in vitro. Esta técnica robusta oferece ferramentas promissoras para diagnóstico e terapia da doença de Alzheimer.

Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer

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