Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios
12 de junho de 2010
Este artigo ilustra como usar corretamente o BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmidial em células epidérmicas de cebola e como testar para interações proteína-proteína em células de cebola com base no princípio de Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC)
Este procedimento testa in vivo a interação proteína-proteína entre dois reguladores de transcrição Arabidopsis, seus soletrados SEU, em suma e lu holog ou LUH. Ao utilizar a complementação de fluorescência biomolecular, seus é fundido ao fragmento terminal final de uma proteína fluorescente amarela, ou YFP e LUH é fundido ao fragmento terminal C de Y-F-P-D-N-A das duas construções de plasmídeo. Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P são bombardeados em células epidérmicas de cebola para testar sua interação.
Uma interação entre Seuss e LUH provoca a associação dos fragmentos do terminal final e do terminal C de YFP nos núcleos, levando à fluorescência do YFP nos núcleos. Após incubação por 16 a 20 horas no escuro, as cascas epidérmicas da cebola são observadas em microscópio de fluorescência para visualizar a fluorescência. Olá, sou Courtney Hollander, do laboratório do Dr. Zhi Lu no Departamento de Biologia Celular e Genética Molecular da Universidade de Maryland.
Hoje mostraremos um procedimento para testar a interação proteína-proteína em células de cebola usando a pistola genética BioRad Helios. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para testar interações proteína-proteína e localização de proteínas em células vegetais. Então vamos começar.
Para iniciar este procedimento, prepare os cartuchos para a arma genética Helios seguindo o Joe Video Protocol de Woods e Zeto 2008, que demonstra em detalhes o procedimento de preparação do cartucho para cada preparação de cartuchos. 50 microgramas de DNA plasmático total são misturados com 12,5 miligramas de partículas de ouro e 0,5 miligramas por mililitro de solução de PVP para BIFC. Combinando a mesma preparação de cartucho, os dois DNAs plasmáticos das proteínas de interação putativas Seuss se fundiram à metade terminal N de YFP, abreviados seus, NYFP e LU Homólogo fundidos à metade terminal C de YFP abreviado L-U-H-C-Y-F-P.
A quantidade combinada é de 50 microgramas por preparação, rendendo até 50 cartuchos a um micrograma de DNA por 0,25 miligramas de ouro por cartucho. Cada cartucho é para um tiro. Após a preparação do cartucho, teste os cartuchos para saber se as partículas de ouro são impulsionadas com eficiência.
Enrole um pedaço quadrado de paraforma em torno de uma placa de Petri. Em seguida, defina a pressão do hélio entre 150 e 200 PSI e dispare os cartuchos recém-fabricados no quadrado do param. Observe partículas de ouro fracas no parfum.
Diferentes quantidades de partículas de ouro podem ser impulsionadas para o parfum em diferentes pressões de hélio. No entanto, se não houver diferença significativa, escolha a pressão mais baixa para o bombardeio. Este teste também indica a área coberta por cada procedimento de tiro.
Para preparar os tecidos da cebola, retire a casca externa de uma cebola amarela grande usando uma lâmina de barbear limpa e afiada. Corte uma área retangular de dois por oito centímetros, com quatro a cinco camadas de profundidade. Retire o tecido retangular da cebola e descarte as duas camadas externas.
Corte as camadas restantes da cebola em pedaços quadrados de cerca de 1,5 centímetro. Coloque os pedaços de cebola em uma placa de Petri contendo círculos de papel de filtro de três mm. Umedecido com água estéril, cubra a placa de Petri.
Os pedaços de cebola estão prontos para o bombardeio. Primeiro: Carregue os cartuchos nos suportes de cartucho redondos brancos, carregue os cartuchos contendo diferentes construções de plasmídeo em diferentes suportes de cartucho. Cada suporte de cartucho pode conter até 12 cartuchos para 12 tiros.
Três suportes diferentes são carregados aqui. O primeiro suporte possui cartuchos contendo 35 S-G-F-P-A promotor forte e constitutivo do vírus do mosaico da couve-flor. Este plasmídeo serve como um controle positivo.
O segundo suporte é carregado com os cartuchos experimentais contendo uma quantidade igual de S-E-U-N-Y-F-P e L-U-H-C-Y-F-P. O terceiro suporte do cartucho é carregado com cartuchos contendo uma mistura molar igual do vetor da espinha do disco e do tempero do disco LUH. Isso também serve como um controle negativo.
Insira a bateria e o revestimento do cano novo na pistola genética Helios. Certifique-se de que o revestimento do cano e a pistola tenham seus respectivos anéis de vedação conectados. Em seguida, insira um suporte de cartucho vazio na pistola genética com a marca número 12 no suporte do cartucho voltado para a parte superior da pistola.
Avance o suporte do cartucho uma ou duas vezes para certificar-se de que está inserido corretamente. Em seguida, conecte a pistola ao tanque de hélio e ajuste a pressão entre 150 e 200 PS. Eu uso proteção para os ouvidos e disparo a arma algumas vezes mantendo pressionado o botão lateral enquanto puxo o gatilho. Disparar a arma com o suporte do cartucho vazio, carregá-lo, limpa a câmara da arma e garante que a pressão seja estável.
Antes de disparar o DNA, atirar em um pedaço de cebola aqui pode ser um controle negativo para a fluorescência de fundo. Para disparar as partículas de ouro revestidas com DNA, remova o suporte do cartucho vazio e insira o primeiro suporte do cartucho carregado contendo o controle positivo. Avance o suporte do cartucho de forma que o cartucho destinado ao disparo fique posicionado na parte inferior do suporte do cartucho.
Agora coloque os pedaços de cebola no meio de uma placa de Petri vazia com a camada mais interna da cebola voltada para cima. Descanse o revestimento do cano da arma genética na placa de Petri e dispare a arma. Avance para o próximo cartucho e atire em um pedaço de cebola diferente.
Repita esta etapa até que quatro a cinco pedaços de cebola sejam disparados. Cada pedaço de cebola é baleado apenas uma vez após o tiro. Transfira o pedaço de cebola bombardeado para uma placa de Petri contendo papel de filtro úmido de três mm para disparar os cartuchos experimentais.
Mude para o cartucho Holden. Número dois, lembre-se de trocar o revestimento do cano para evitar contaminação. Atire de quatro a cinco pedaços de cebola, conforme mostrado para o controle positivo.
Em seguida, mude para o cartucho Holden. Número três, contendo o DNA de controle negativo. E, novamente, atire de quatro a cinco pedaços de cebola.
Troque o revestimento do cano para evitar contaminação. Após o bombardeio. Cubra as placas de Petri contendo os pedaços de cebola com tampas.
Envolva-os com paraforme para evitar o ressecamento. Incube os pedaços de cebola em temperatura ambiente no escuro por 16 a 48 horas. Terminado o bombardeio, desligue o gás e libere a pressão antes de retirar a arma genética do tanque de hélio, desparafuse o revestimento do cano e remova o suporte do cartucho e os cartuchos usados.
Por fim, limpe os porta-cartuchos e os revestimentos do cano submergindo-os em um copo com água e sabão e sonicate. Por 20 minutos. Em seguida, enxágue com água para remover todos os resíduos de sabão.
Mergulhe em etanol 70% por uma hora e depois seque em papel toalha. Prossiga para observar os pedaços de cebola 16 a 20 horas após o bombardeio. Depois de incubar os pedaços de cebola bombardeados por 16 a 20 horas em temperatura ambiente, use uma pinça com pontas planas para descascar lentamente uma única camada de célula da epiderme interna da cebola.
Esta é a camada que fica diretamente voltada para a arma durante o bombardeio. Coloque a camada descascada sobre uma gota de água em uma tampa deslizante com uma lamínula. Mas tome cuidado para minimizar as bolhas.
Observe a fluorescência GFP ou YFP usando um microscópio de fluorescência, como o observador zes axio, ponto Z mostrado aqui sob o campo claro do microscópio. Primeiro, verifique se há fluxo citoplasmático para garantir que as células estejam vivas. Para fazer isso.
Exponha o slide à luz do campo brilhante por alguns minutos para aquecer o tecido da cebola e, em seguida, procure plásticos em movimento citoplasmático O fluxo nem sempre é fácil de ver, portanto, não desanime se não for claramente visível. Para detecção de fluorescência, use filtros de excitação e detecção apropriados para GFP ou YFP. Verifique também os controles negativos, que são os pedaços de cebola disparados com um plasmídeo não fluorescente.
Sinais amarelos fracos podem aparecer de células feridas, detritos e cebolas. Além disso, verifique os controles positivos. O plasmídeo contendo repórter fluorescente expresso constitutivamente.
A fluorescência GFP é observada em algumas, mas não em todas as células. Bolhas de ar também podem produzir fluorescência de fundo. Sinais visíveis de GFP das células epidérmicas da cebola indicam que os cartuchos, os tecidos da cebola e o disparo da arma genética estão devidamente preparados e executados.
Aqui é mostrada a forte fluorescência observada do plasmídeo positivo 35 SGFP. A forte fluorescência é vista em toda a célula, incluindo o núcleo e o citoplasma. A imagem de campo claro permite ver o contorno correspondente das células e núcleos.
Nem toda célula é transformada. O sinal fluorescente YFP é detectado no núcleo da célula da cebola quando a combinação experimental Seuss, NYFP e L-U-H-C-Y-F-P é bombardeada em células de cebola, indicando que Seuss NYFP e L-U-H-C-Y-F-P interagem in vivo. No entanto, essa fluorescência mediada por interação é significativamente mais fraca do que a fluorescência mediada por 35 SGFP no controle positivo.
Além disso, os fatores de transcrição SEUS e LUH estão localizados nos núcleos. Assim, a fluorescência YFP é observada apenas no núcleo. Além disso, o número de células fluorescentes é significativamente menor do que o do controle positivo de 35 SGFP.
Isso ocorre porque o B FFC só funciona quando ambos os plasmídeos parceiros são expressos nas mesmas células de cebola. Nenhum sinal fluorescente é detectado nas cebolas, bombardeadas com o suporte do cartucho número três contendo uma mistura de espinha de disco, vetor e L-U-H-C-Y-F-P Como é esperado do controle negativo. Acabamos de mostrar como bombardear células de cebola para testar interações proteína-proteína usando o sistema de pistola genética BioRad Helios.
Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de usar controles positivos e negativos adequados e saber que a fluorescência BIFC pode ser mais fraca no sinal e menor no número de células fluorescentes. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo demonstra o uso da BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmídico em células epidérmicas de cebola. Também detalha um método para testar interações proteína-proteína usando Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC).
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Genética Molecular
- Biologia Vegetal
Fundamentos
- Interações proteína-proteína são cruciais para entender processos celulares.
- Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC) é uma técnica usada para estudar essas interações in vivo.
- Células epidérmicas de cebola servem como um sistema modelo para tais estudos.
- A BioRad Helios Gene Gun é uma ferramenta eficaz para entregar DNA plasmídico em células vegetais.
Propósito do Estudo
- Ilustrar o uso da BioRad Helios Gene Gun para entrega de genes.
- Demonstrar o método BiFC para detectar interações de proteínas.
- Fornecer um protocolo prático para pesquisadores em biologia molecular vegetal.
Métodos Usados
- Construções plasmídicas para SEU e LUH foram criadas com fragmentos YFP.
- Células epidérmicas de cebola foram bombardeadas com essas construções usando a Gene Gun.
- As células foram incubadas no escuro por 16 a 20 horas.
- Microscopia de fluorescência foi usada para visualizar a fluorescência YFP nos núcleos.
Principais Resultados
- A introdução bem-sucedida de DNA plasmídico nas células de cebola foi alcançada.
- A fluorescência YFP indicou uma interação proteína-proteína entre SEU e LUH.
- A fluorescência foi localizada nos núcleos das células.
- O método provou ser eficaz para estudar interações de fatores de transcrição.
Conclusões
- A BioRad Helios Gene Gun é um método confiável para entrega de genes em células vegetais.
- BiFC é uma técnica valiosa para visualizar interações de proteínas in vivo.
- Este estudo fornece uma estrutura para futuras pesquisas em genética molecular vegetal.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction validation is a critical step in target de-risking for biopharma discovery pipelines. The BiFC assay in onion cells provides a rapid, visual readout for confirming intracellular interactions, supporting early hypothesis testing and mechanistic confidence. This approach enables scalable, low-background screening of transcription factor complexes relevant to disease pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of transcription factor interactions in living plant cells, supporting functional validation of putative targets.
- Operational Value: Utilizes onion epidermal cells as a reproducible, low-autofluorescence system for transient expression and interaction screening.
- Predictive Value: Nuclear-localized YFP signal confirms co-localization and interaction of SEU and LUH, providing mechanistic insight into transcriptional regulatory complexes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Plasmid DNA delivery via Helios Gene Gun allows standardized, high-efficiency transfection of onion epidermal cells for interaction testing.
- Quantitative Output: Fluorescence intensity and subcellular localization (nuclear vs. cytoplasmic) provide measurable readouts for interaction strength and specificity.
- Scalability: Multiple constructs (positive, experimental, negative controls) can be tested in parallel using separate cartridge holders, enabling comparative screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: While performed in a plant model, the assay framework supports conservation of interaction networks applicable to eukaryotic transcriptional regulation.
- Mechanistic De-risking: Observed nuclear YFP fluorescence upon co-bombardment of SEU-NYFP and LUH-CYFP validates intracellular interaction, reducing false-positive risk in target validation.
- Translational Continuity: The BiFC-Helios Gene Gun workflow establishes a reusable platform for testing protein interactions in semi-intact cellular environments.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC assay integrated with Helios Gene Gun bombardment fits within early discovery workflows, supporting target validation prior to lead identification and preclinical assessment.
- Discovery Biology: Tests intracellular protein-protein interactions in situ, clarifying whether putative partners co-localize and associate in a native-like cellular context.
- Screening: Enables standardized delivery of plasmid pairs via gene gun, ensuring reproducible transfection efficiency across biological replicates.
- Analytics: Nuclear YFP fluorescence serves as a quantitative, imaging-based readout for interaction confirmation, complementing biochemical assays.
- Translational Research: While using onion cells, the method supports conservation of interaction mechanisms relevant to human transcription factor networks.
- Enterprise Reuse: The Helios Gene Gun and BiFC protocol can be adapted across multiple protein pairs and plant-based expression systems for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides spatial and temporal resolution of protein interactions in living cells, reducing reliance on lysate-based assays that may miss transient or context-dependent associations.
- Operational Value: Combines transient expression with visual readout, enabling rapid iteration and optimization of construct design and delivery parameters.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions on target pairs by confirming intracellular interaction, thereby reducing investment in non-validated hypotheses.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of transcription factor complexes with demonstrated nuclear co-interaction, improving risk-adjusted target selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to generate N- and C-terminal YFP fusion constructs.
- Dependent on Helios Gene Gun optimization, including helium pressure (150–200 PSI), gold particle preparation, and cartridge standardization.
- Necessitates fluorescence microscopy with appropriate YFP filter sets and controls for background signal from wounded cells or debris.
- Requires standardized incubation (16–20 hours in dark) to allow for protein expression, interaction, and fluorophore maturation.
- Limited by transfection efficiency; not all cells are transformed, necessitating population-level analysis and use of positive/negative controls for interpretation.
