Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar a expressão gênica em tecidos e estágios de desenvolvimento do besouro-azul usando PCR quantitativa. Isso é alcançado por meio da dissecação de tecidos larvais e da categorização dos estágios de desenvolvimento. Como segundo passo, extrai-se o RNA de tecidos e estágios de desenvolvimento usando o reagente triol, que é então usado como molde para gerar a fita complementar de cDNA, seguindo a síntese da fita complementar de cDNA. Em seguida, é realizada a qRT-PCR.

Os resultados obtidos demonstram a expressão diferencial do gene-alvo em diversos tecidos larvais e estágios de desenvolvimento, com base nos dados completos de variação obtidos a partir dos valores de limiar de ciclo. Após amplificações pós-R-T-P-C-R quantitativa. Olá, sou Prakash Mi, o pesquisador responsável por este laboratório no Departamento de Entomologia da Ohio State University.

O meu laboratório foca principalmente os aspectos genômicos ou moleculares das interações entre emal, lash, burer e freixo. O emal, lash burer ou EAB é uma praga exótica invasora da China que ameaça a própria existência das populações de freixo em toda a América do Norte. Hoje, mostraremos um protocolo para análise de expressão gênica no EAB utilizando QPCR ou PCR quantitativo em tempo real.

E os membros do laboratório que participarão deste protocolo são Swapna Priou, que realizará as dissecações de válvulas, e Bin Bandari, que demonstrará o isolamento de RNA. Por fim, Lauren Rivera Vega fará a análise de QPC. Também utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a expressão gênica de ash.

Então vamos começar. Antes do início deste procedimento, coloque larvas de emerald ash B ou EAD sobre papel-toalha úmido. Até que as dissecações sejam realizadas, mantenha a solução salina tamponada com fosfato a um x, recém-preparada, ou PBS, sobre gelo para manter o tampão frio durante toda a dissecação.

Para começar, fixe as larvas de EAB na placa de dissecação com pinos finos de dissecação. Em seguida, adicione PBS 1x frio à placa de dissecação. Primeiro, decapite as larvas com um par de tesoura fina de dissecação.

Posteriormente, remova o último segmento abdominal das larvas usando uma pinça de relojoeiro. Levante a cutícula do cadáver larval e, em seguida, faça uma incisão ao longo do comprimento do cadáver usando uma tesoura. Tenha cuidado para não romper o intestino.

Conforme a incisão for feita, isole cuidadosamente o tecido do intestino médio dos outros tecidos, como corpos gordurosos e tecido conjuntivo. Em seguida, lave o tecido em tampão PBS 1X fresco para garantir que não haja contaminação por corpo gorduroso. Transfira o intestino médio para 500 microlitros de reagente TRIol pré-resfriado em um tubo eppendorf de 1,5 mililitro.

Em seguida, isole o tecido do corpo gorduroso usando pinças e transfira-o para um tubo eppendorf de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de reagente triol gelado. Por fim, isole o tecido da cutícula da carcaça larval raspando qualquer tecido aderente, tomando cuidado para não danificar a integridade tecidual.

Lave o tecido de cutícula isolado em tampão PBS fresco e transfira-o para um tubo eppendorf de 1,5 mililitro com 500 microlitros de reagente de triazol gelado. Os tecidos isolados de corpo gorduroso, cutícula e intestino médio podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA. Em preparação para a extração de RNA, separe as diversas amostras de EAB de acordo com os estágios de desenvolvimento.

Essas fases incluem primeira, segunda, terceira e quarta fases em estrelas, PrepU e adultos. Para iniciar a extração de RNA, primeiro use pistilos de plástico para homogeneizar os tecidos no triol contendo tubos einor de 1,5 mililitro. Após a homogeneização, ajuste o volume total de cada amostra para um mililitro com o reagente triol.

Para as fases de desenvolvimento, homogeneíze o animal inteiro em nitrogênio líquido com um almofariz e pistilo. Em seguida, adicione uma alíquota do homogeneizado a um mililitro de triol. Incube os tubos de amostra com um mililitro de triol por 15 minutos à temperatura ambiente.

Após a incubação, adicione 200 microlitros de clorofórmio a cada tubo imediatamente após a adição do clorofórmio. Agite os tubos vigorosamente por cerca de 15 segundos. Em seguida, incube os tubos à temperatura ambiente por mais dois a três minutos.

Em seguida, centrifugue as amostras a 12.000 ×g por 15 minutos a dois graus Celsius. Após a centrifugação, o RNA estará na fase aquosa. O volume da fase aquosa deve ser de 600 microlitros ou 60% do volume total da triol.

Remova cuidadosamente apenas a fase aquosa. A presença de substâncias abaixo da fase aquosa causará contaminação do RNA extraído. Em seguida, transfira a fase aquosa para um tubo einor de 1,5 mililitro devidamente identificado.

Para precipitar o RNA da fase aquosa, adicione 0,5 mililitros de álcool isopropílico a cada tubo. Incube as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, centrifugue os tubos a 12.000 Gs por 10 minutos a dois graus Celsius. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante dos tubos.

O RNA está presente no pellet com aspecto gelatinoso formado no fundo do tubo. Lave o pellet com etanol a 75%, adicionando pelo menos um mililitro de etanol a 75% por cada mililitro misturado por vortex. Em seguida, centrifugue os tubos a 7.500 ×g durante cinco minutos a dois graus Celsius.

Descarte o sobrenadante dos tubos. Centrifugue os tubos novamente na centrífuga de bancada por um minuto. Remova qualquer sobrenadante residual do tubo por pipetagem cuidadosa.

Deixe o tubo aberto e permita que o pellet seque ao ar por cinco a dez minutos. Tenha cuidado para não secar em excesso o pellet, pois isso reduzirá significativamente sua solubilidade após a secagem ao ar. Ressuspenda o pellet em percarbonato de dathyl ou água tratada com dep sea.

A quantidade de água utilizada para ressuspender o pellet dependerá do tamanho do pellet. Utilize 50 microlitros de água do mar tratada para um pellet pequeno ou 100 microlitros para um pellet grande. Deixe o pellet dissolver completamente na água do mar tratada movendo a ponta da pipeta para cima e para baixo várias vezes.

Uma vez que o precipitado tenha se dissolvido, coloque a amostra a 55 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, meça a concentração de cada amostra de RNA utilizando um espectrofotômetro NanoDrop. Por fim, realize a síntese do primeiro filamento de cDNA para as respectivas amostras de RNA usando o sistema de síntese do primeiro filamento SuperScript da Invitrogen para RT-PCR.

Este procedimento pode ser encontrado na parte escrita deste protocolo. Para iniciar a PCR quantitativa em tempo real ou Q-R-T-P-C-R, projete cada par de primers para ter uma temperatura de fusão de 60 graus Celsius e um tamanho do produto de aproximadamente 100 pares de bases. O AP par um é usado como o gene de interesse para este experimento.

Um gene de referência ou controle interno é necessário para a análise posterior e normalização dos dados. Aqui, a proteína ribossomal a P RRP um é utilizada como gene de referência. Em seguida, projete um modelo indicando o nome da amostra para cada poço e a placa de qPCR.

Lembre-se de incluir padrões para cada gene e pelo menos duas réplicas técnicas por amostra. Em seguida, ligue a máquina de PCR em tempo real e insira os parâmetros de ciclagem para configurar a placa para a máquina CFX 96. Primeiro, prepare a mistura mestra para cada gene em um tubo separado para cada poço.

A mistura mestra consiste em dois microlitros de água livre de nucleases, quatro microlitros de cyber green 2,5 x, um microlitro de iniciador (primer) sentido direto e um microlitro de iniciador sentido reverso, totalizando oito microlitros. De acordo com o modelo previamente projetado, adicione dois microlitros de cDNA a cada poço. Em seguida, adicione oito microlitros da mistura mestra a cada poço, resultando em um volume total de 10 microlitros por reação. Pipete para cima e para baixo para garantir que a amostra esteja bem misturada.

Verifique se nenhum líquido permanece na ponta. Para evitar contaminação cruzada, use uma ponta nova para cada amostra. Depois que toda a placa for preparada, cubra a placa com fita óptica.

Evite tocar a fita, pois a presença de graxa pode afetar a leitura. Em seguida, centrifugue a placa a 500 RPM por um minuto para garantir que todos os produtos nos poços estejam na parte inferior da placa após a centrifugação. Verifique se não há gelo ou água na parte inferior da placa.

Por fim, coloque a placa na máquina de PCR em tempo real e execute o programa de PCR com resultados representativos para larvas de EAB. A dissecação e a PCR em tempo real são mostradas aqui. A dissecação da larva de EAB deve revelar o intestino médio no centro da larva de EAB.

O intestino médio da larva de EAB é isolado conforme mostrado aqui, com os valores médios de expressão relativa ou VARs. Os valores para o gene paratropina AP par um são mostrados aqui para diferentes tecidos larvais, incluindo cutícula, intestino médio e corpos gordurosos. A proteína ribossomal específica de EAB, ARP um, foi utilizada como controle interno para normalizar os dados obtidos para o gene de interesse.

A variação relativa da expressão de AP AP par um foi extraída para os diferentes tecidos larvais. O tecido da cutícula apresentou a menor expressão e, portanto, foi utilizado como amostra calibradora média de RVs para AP Perry. Um em diferentes estágios de desenvolvimento de EAB, incluindo as fases larvais de primeiro, segundo, terceiro e quarto ínstar.

O PrepU e os adultos foram determinados utilizando-se o aprp um como controle interno para normalizar os dados. A variação relativa da expressão de AP Perry um foi determinada para diversos estágios de desenvolvimento. Neste caso, a amostra PrepU apresentou o menor nível de mRNA e, portanto, foi utilizada como calibrador.

Acabamos de mostrar como realizar dissecações laterais e, posteriormente, análise de expressão gênica utilizando a região lateral, bem como diversas fases de desenvolvimento de Emeral ra, por meio de R-T-P-C-R quantitativo durante este procedimento. Você deve ter cuidado durante a dissecação para não contaminar cruzadamente as amostras de tecido. Além disso, é necessário ter atenção ao realizar a Q-R-T-P-C-R para pipetar as amostras respectivas na lâmina de PCR correspondente.

Então é isso. Obrigado por assistir ao nosso vídeo e boa sorte com seus experimentos.