Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens de células neurais com alta resolução no embrião de peixe-zebra. Primeiramente, o DNA que codifica a proteína verde fluorescente direcionada à membrana é injetado em um embrião de peixe-zebra em estágio de uma única célula, o que resulta em herança em mosaico, permitindo assim uma visualização aprimorada de células dispersas. Os embriões são então imunomarcados com anticorpo anti-GFP e seccionados, possibilitando a visualização da morfologia de células individuais com alta resolução em uma preparação fixada. Alternativamente, embriões vivos podem ser analisados utilizando microscopia de vídeo com lapso de tempo, a fim de registrar a dinâmica celular.

São obtidos resultados que mostram a morfologia ou a dinâmica celular. Aqui, o cérebro posterior do peixe-zebra é visualizado por microscopia confocal. Olá a todos.

Sou PR Chandran do laboratório da Dra. Rachel Brewster do departamento de ciências biológicas da Universidade de Maryland no Condado de Baltimore. Hoje vamos mostrar um procedimento para marcar e imaginar células neurais em embriões de peixe-zebra com maior resolução. Normalmente utilizamos este procedimento em laboratório para estudar os mecanismos de relação neural em embriões de peixe-zebra em nível celular.

Então vamos começar. Coloque toalhetes umedecidos de papel ao redor da borda de uma placa de Petri de 100 milímetros.

Fixe cuidadosamente uma agulha de microinjeção de vidro sobre uma tira de cera dentro do recipiente umidificado. Sob um microscópio estereoscópico de dissecação, alinhe a agulha em relação a uma lâmina graduada. Para obter uma ponta do tamanho apropriado, use uma lâmina de barbear limpa para tocar suavemente a agulha no ponto onde ela apresenta um diâmetro de um micrômetro.

Conecte a agulha à pipeta do aparelho de microinjeção, colocando 0,5 microlitros de uma solução de vermelho de fenol e água sobre uma película de parafina e preencha a agulha pela extremidade frontal a partir das gotas. Ajuste a pressão de microinjeção para sete quilopascais e inicie com um pulso de 20 milissegundos. Conte o número de pulsos necessários para dispensar todo o líquido. Varie o tempo entre 10 e 30 milissegundos de modo que sejam necessários aproximadamente 250 pulsos para dispensar completamente.

0,5 microlitros de solução. Use uma micropipeta para preencher a agulha com 0,5 a um microlitro de MG FPD NA em água, misturado com vermelho de fenol para visualização. Cubra a placa umidificada para prevenir a evaporação da solução da agulha sob o microscópio estereoscópico.

Posicione embriões de peixe em estágio de uma célula separados em uma placa de Petri de 60 milímetros preenchida com meio embrionário. Use pinças finas para segurar suavemente o córion e estabilizar o embrião. Mova a agulha preenchida com MGFP e vermelho de fenol até a área-alvo para injeção.

Para expressão ampla de MGFP, injete no vitelo ou no citoplasma. Use o aparelho de microinjeção para administrar aproximadamente dois nanolitros da solução de MGFP. Observe a localização do indicador vermelho de fenol para confirmar a injeção adequada.

Remova cuidadosamente a agulha do embrião. Injete todos os embriões na placa, até 30 embriões de cada vez. Evite expor os embriões à luz e incube-os a 28,5 graus Celsius para permitir que os embriões se desenvolvam até o estágio desejado sob o microscópio estereoscópico.

Use pinças finas para remover suavemente o cório dos embriões. Use uma pipeta de pasta para retirar o cório vazio da placa, deixando apenas os embriões descorionados. Use uma pipeta de pasta polida ao fogo para transferir os embriões injetados descorionados para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mililitro.

Remova o máximo de meio extra possível, depois adicione um mililitro de ative. Lave os embriões em uma XPBS à temperatura ambiente três vezes, por cinco minutos cada. Transfira os embriões para uma placa de Petri contendo uma XPBS sob o microscópio estereoscópico.

Use pinças finas para segurar o embrião próximo à região da cauda. Use um segundo par de pinças ou uma haste para tentar remover o máximo de gema possível sem tocar a região do esqueleto posterior. Observando sob o microscópio estereoscópico, use as pinças finas para levantar o embrião do recipiente e colocá-lo em um molde para inclusão preenchido com ponto de fusão baixo a 4%.

Posicione o embrião em direção a uma extremidade do molde. Deixe o aros solidificar à temperatura ambiente. Use uma espátula para remover o bloco endurecido de aros do molde, elevando a lâmina para cortar uniformemente a extremidade inferior do bloco.

Use uma gota de cola super resistente para fixar o bloco na plataforma do vibratomo com o lado cortado voltado para baixo, se desejar. Alinhe vários blocos na plataforma. Fixe a plataforma ao vibratomo.

Certifique-se de que a lâmina corte completamente cada embrião, mas sem atravessar totalmente o bloco. Encha o estágio com uma seção de XPBS. Corte cuidadosamente os embriões até o fundo de um bloco de agarose e transfira-o para uma placa de Petri contendo XPBS.

Seccione as partes sob o microscópio estereoscópico. Use pinças finas para colocar as seções desejadas em uma placa de múltiplos poços contendo um XPBS. Utilize um poço diferente para cada embrião.

Corar as seções com DPI e imunomarcar com anti-GFP. Caso contrário, realizar a aquisição de imagens em até 48 horas. Montar até seis seções por lâmina e colocar uma lamínula sobre as seções para a microscopia confocal.

Armazene as lâminas no escuro para evitar o desbotamento fotográfico. Para a imagem em tempo real, os embriões injetados com MGFP devem ser protegidos da luz. Use pinças para revestir os embriões 30 minutos antes de atingirem o estágio de desenvolvimento desejado.

Transfira os embriões revestidos para uma solução sedativa de meio embrionário com 0,01% Trica e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Pipete uma gota de 1% agarose regular em água sobre uma placa de cultura de 35 milímetros com fundo de vidro, de modo que preencha o molde. Deixe a agarose solidificar.

Use o tubo capilar de vidro de 90 milímetros para fazer três furos na gota de aros sob o microscópio estereoscópico. Examine a parte inferior do poço e remova qualquer resíduo de aros com pinça. Encha o recipiente com meio para embrião sob o microscópio estereoscópico.

Use uma pipeta de Pasteur para transferir um embrião para cada orifício nos anéis. Use pinças finas para orientar o embrião de modo que a área de interesse, neste caso a cabeça dorsal, fique apoiada contra o vidro. Cubra a placa.

Transporte cuidadosamente a placa para a platina de um microscópio confocal. Utilize aquecedores de ambiente para manter os embriões a 28,5 graus Celsius durante toda a aquisição de imagens. Abaixo, uma seção através do cérebro posterior de um embrião selvagem entre quatro e cinco somitos, marcado duplamente com GFP direcionado à membrana em verde e D em azul; apenas uma célula está marcada com GFP ligado à membrana, permitindo a aquisição de imagens com alta resolução da morfologia e organização celulares.

Esta é uma imagem comparável do cérebro posterior de um embrião mutante nardi din em estágio de quatro a cinco somitos. Esta imagem revela que as células em embriões nardi e mutantes não conseguem se orientar corretamente em direção à linha média durante a neurulação. Em contraste com o método de marcação celular com MGFP, a marcação do cérebro posterior com um marcador geral da superfície celular, como a beta-catenina, não permite a visualização da morfologia de células individuais.

A imagem em lapso de tempo do cérebro posterior de um embrião marcado com MG FP revela que os comportamentos celulares que impulsionam a neurogênese no peixe-zebra são muito dinâmicos e envolvem a extensão de protrusões da membrana enquanto as células migram e se intercalam. Acabamos de mostrar como preparar embriões de peixe-zebra fixados e vivos para imagem individual de células com alta resolução. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.