Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens de células neurais em alta resolução No embrião de peixe-zebra primeiro, a proteína fluorescente verde direcionada à membrana que codifica o DNA é injetado em um embrião de peixe-zebra em estágio de uma célula, o que resulta em herança em mosaico, permitindo assim imagens aprimoradas de células dispersas. Os embriões são então imunomarcados com anti-GFP e seccionados, permitindo a visualização da morfologia de células individuais em alta resolução em uma preparação fixa. Alternativamente, embriões vivos podem ser examinados usando microscopia de vídeo com lapso de tempo para obter imagens da dinâmica celular.

São obtidos resultados que mostram a morfologia ou dinâmica celular. Aqui, o cérebro posterior do peixe-zebra é fotografado com microscopia confocal. Olá a todos.

Eu sou PR Chandran do laboratório da Dra. Rachel Brewster no departamento de ciências biológicas da Universidade de Maryland Baltimore County. Hoje mostraremos um procedimento para rotular e criar imagens de células neurais em embriões de peixe-zebra em resolução mais alta. Normalmente usamos esse procedimento em laboratório para estudar os mecanismos de neuro-relação no embrião de peixe-zebra em nível celular.

Então vamos começar. Coloque molhado. Kim limpa a borda de uma placa de Petri de 100 milímetros.

Prenda cuidadosamente uma agulha de microinjeção de vidro em uma tira de cera dentro do prato umidificado. Sob um microscópio estéreo de dissecação, alinhe a agulha contra uma lâmina graduada. Para obter uma ponta do tamanho apropriado, use uma lâmina de barbear limpa para bater suavemente na agulha onde ela tem um diâmetro de um micrômetro.

Conecte a agulha ao aparelho de microinjeção, pipete 0,5 microlitros de uma solução de vermelho de fenol e água no filme paralímpico e encha a agulha com as gotículas. Defina a pressão de microinjeção para sete quilo pascals e comece com um pulso de 20 milissegundos Conte o número de pulsos necessários para dispensar todo o líquido. Varie o tempo entre 10 e 30 milissegundos para que demore aproximadamente 250 pulsos para dispensar.

0,5 microlitros de solução. Use uma micropipeta para preencher a agulha com 0,5 a um microlitro de MG FPD NA em água, misturado com vermelho de fenol para visualização. Cubra o prato umidificado para evitar a evaporação da solução da agulha sob o microscópio estéreo.

Posicione embriões de peixes separados em um estágio celular em uma placa de Petri de 60 milímetros cheia de embriões. Média. Use uma pinça fina para segurar suavemente o Corian e estabilizar o embrião. Mova a agulha cheia de MGFP e vermelho de fenol para a área alvo para injeção.

Para expressão de MGFP de ampla faixa, injete na gema ou no citoplasma. Use o aparelho de microinjeção para fornecer aproximadamente dois nanolitros da solução MGFP. Observe a localização do indicador vermelho de fenol para confirmar a injeção adequada.

Remova cuidadosamente a agulha do embrião. Injete todos os embriões no prato até 30 embriões de uma só vez. Evite expor os embriões à incubação leve a 28,5 graus Celsius para permitir que os embriões se desenvolvam até o estágio desejado sob o microscópio estereoscópico.

Use uma pinça fina para descascar suavemente o Corian dos embriões. Use uma pipeta de macarrão para remover o corian vazio do prato, deixando apenas os embriões revestidos com dec. Use uma pipeta de massa polida a fogo para transferir os embriões revestidos injetados para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Remova o máximo de meio extra possível e adicione um mililitro de ativo. Lave os embriões em temperatura ambiente um XPB S3 vezes por cinco minutos cada. Mova os embriões para uma placa de Petri cheia de um XPBS sob o microscópio estéreo.

Use uma pinça fina para segurar o embrião perto da região da cauda. Use um segundo conjunto de pinças ou um atiçador para tentar remover o máximo possível sem tocar na região da estrutura traseira. Olhando sob o microscópio estéreo, use a pinça fina para levantar o embrião do prato e colocá-lo em um molde de corte preenchido com 4% de baixo ponto de fusão. Aros.

Posicione o embrião em direção a uma extremidade do molde. Deixe o aros solidificar à temperatura ambiente. Use uma espátula para remover o bloco aros endurecido do molde com um levantamento de lâmina cortando a extremidade inferior do bloco uniformemente.

Use uma gota de super cola para ancorar o bloco no vibrato stage com o lado cortado voltado para baixo, se desejar. Alinhe vários blocos no cenário. Anexe o palco ao vibrato.

Certifique-se de que a lâmina cortará todo o embrião, mas não completamente através do bloco. Preencha o palco com uma seção XPBS. Os embriões cortam cuidadosamente na parte de trás de um bloco de arou e o transferem para uma placa de Petri cheia de um XPBS.

Separe as seções sob o microscópio estéreo. Use uma pinça fina para colocar as seções desejadas em um prato de vários poços cheio de um XPBS. Use um poço diferente para cada embrião.

Manchar as seções com DPI e imunomarcador com anti GFP. Caso contrário, exames de imagem em até 48 horas. Monte até seis seções por lâmina e coloque uma lamínula no topo das seções para imagens confocais.

Guarde os slides no escuro para evitar o branqueamento das fotos. A imagem ao vivo, os embriões injetados pelo MGFP devem ser protegidos da luz. Use uma pinça para revestir os embriões 30 minutos antes de atingirem o estágio de desenvolvimento desejado.

Transfira os embriões revestidos para uma solução sedativa de meio embrionário com 0,01% de Trica e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. A gota de pipeta de 1% regular surgiu em água em uma placa de cultura com fundo de vidro de 35 milímetros para preencher o molde. Deixe os agros solidificarem.

Use o tubo capilar de vidro de 90 milímetros para fazer três furos na gota de aros sob o microscópio estéreo. Examine o fundo do poço e remova qualquer aros residual com uma pinça. Encha o prato com meio embrionário sob o microscópio estéreo.

Use uma pipeta de macarrão para transferir um embrião para cada orifício no aros. Use uma pinça fina para orientar o embrião de modo que a área de interesse, neste caso, a cabeça dorsal, fique apoiada no vidro. Cubra o prato.

Transporte cuidadosamente a antena parabólica para o estágio de um microscópio confocal. Use aquecedores de ambiente para manter os embriões a 28,5 graus Celsius durante toda a imagem. Aqui está uma seção através do cérebro posterior de um embrião de tipo selvagem em quatro a cinco somitos duplamente marcados com GFP direcionada à membrana em verde e D em azul, apenas uma célula é marcada com GFP ligada à membrana, permitindo imagens de alta resolução da morfologia e organização celular.

Esta é uma imagem comparável do cérebro posterior de um mutante nardi din em para cinco somitos. Esta imagem revela que as células em nardi e mutantes não conseguem se orientar adequadamente em direção à linha média durante a neurorevelação. Em contraste com o método de marcação de células com MGFP, a marcação do rombencéfalo com um marcador geral de superfície celular, como a beta-catenina, não permite que a morfologia de células individuais seja visualizada.

imagem de lapso de tempo do cérebro posterior de um embrião marcado com MG FP revela que os comportamentos celulares que impulsionam a relação neurológica no peixe-zebra são muito dinâmicos e envolvem a extensão das saliências da membrana à medida que as células migram e se interligam. Acabamos de mostrar como preparar embriões de peixe-zebra fixos e vivos para imagens de células únicas em alta resolução. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.