Flash Freezing e Cryosectioning E12.5 cérebro de camundongo

Olá, sou Spencer Curley da Universidade da Califórnia em Irvine e do laboratório de Ed Maki, e vou demonstrar como realizar a criosseção. Para isso, utilizo primeiramente estes reagentes comumente usados. O composto de inclusão ou meio de inclusão que utilizo é chamado OCT, que significa temperatura ideal para corte.

É uma solução transparente, muito espessa e viscosa, que mantém bem o tecido enquanto você o orienta, e depois congela. Além disso, é solúvel em água, de modo que pode ser removida durante qualquer procedimento de coloração. Então, incluo o tecido em um molde. Esses recipientes para biópsia em moldes criogênicos estão disponíveis em vários tamanhos.

Vou usar este molde menor aqui porque trabalho com tecido embrionário de camundongo. Congelamos rapidamente nosso tecido em nitrogênio líquido. Então, primeiro vou encher este frasco de vácuo de proteção com nitrogênio líquido do nosso tanque aqui.

Antes de congelar rapidamente o tecido, é necessário fazer o que se chama de crioproteção do tecido; caso contrário, o congelamento em si destruirá o tecido. Para isso, mergulha-se o tecido em uma solução de sacarose a 30% durante a noite. Se levar mais tempo, não há problema, desde que o tecido afunde.

E como é possível observar, as cabeças de camundongos do dia embrionário 12,5 afundaram na solução de sacarose, portanto estão prontas para serem congeladas. Agora vou simplesmente despejar o tecido que está na solução de sacarose em uma placa maior, para que eu possa manipular o tecido. Vou pegar um pouco desse OCT e despejá-lo nesta placa de 35 milímetros, que na verdade está apoiada sobre sua tampa, para que eu consiga um ângulo adequado.

Então, o OCT se acumula ao longo da borda em profundidade. Estou usando um par de pinças antigas e rombadas simplesmente porque não é necessário que sejam afiadas e você não quer estragar outro par de pinças. Então, pego-as e levanto uma dessas cabeças com muita delicadeza, colocando-a nesta primeira banho de OCT.

Eu apenas quero revestir o embrião com OCT. Isso permite, para um congelamento melhor e mais uniforme do tecido. Você não quer nenhum resíduo de sacarose ao redor do tecido nem bolhas de ar.

Evite definitivamente bolhas de ar. Então, estou apenas mexendo suavemente o OCT ao redor e sob a cabeça, movimentando a cabeça através do OCT e deixando-a repousar ali por alguns segundos enquanto preencho meu molde criogênico. Agora vou preencher o molde criogênico com o OCT novamente, evitando bolhas.

E eu vou apenas encher até o topo do molde. E como você notará, eu marquei o molde. Assim, poderei ver minha orientação depois que estiver congelado.

Quando o OCT congela, ele fica branco e você não consegue mais ver o seu tecido. Portanto, é essencial etiquetar com uma caneta permanente. O molde de crioseção.

Na verdade, formou-se uma bolha no OCT, então vou usar minha pinça para empurrá-la para fora da borda. Você não quer que isso interfira no congelamento do seu tecido. Agora vou transferir a cabeça deste recipiente para o OCT que está no meu molde.

Vou apenas levantá-lo do recipiente e colocá-lo na forma bem suavemente. Em seguida, vou para o microscópio, onde orientarei o tecido. Tenho o tecido em minha forma de criomoldagem aqui, e vou olhar pelo microscópio para poder orientá-lo.

Vou realizar cortes coronais nesta cabeça de camundongo. Portanto, preciso orientá-la para poder posicioná-la no criostato para cortes coronais. Mais uma vez, estou usando estas pinças antigas e rombudas e, como podem ver, há algumas bolhas aqui, que tentarei remover da melhor forma possível.

Mas essas bolhas menores não são, não são ruins. Não percebi nenhum problema com essas bolhas menores. Você simplesmente não quer bolhas grandes.

Então, vou apenas afastá-los o melhor possível e certamente limpar a pinça com frequência, pois assim é possível evitar bolhas de maneira mais eficaz. Agora, se vocês conseguem ver minha marcação, tenho um T aqui em cima e um F à minha esquerda. Isso apenas me indica que a cabeça, a parte superior da cabeça, ficará voltada para cima e a frente ou o rosto ficará à minha esquerda.

Dessa forma, sei qual superfície cortar para obter seções coronais e estou apenas ajustando levemente o tecido. E novamente, às vezes isso introduz bolhas, e você deve empurrá-las para fora, a fim de que não congelem junto com o tecido. Portanto, é prejudicial ter bolhas, principalmente porque, durante o congelamento, as bolhas no tecido podem causar um congelamento inconsistente.

A finalidade da congelação rápida é garantir que tudo seja congelado de uma só vez. Além disso, ao cortar o tecido no criostato, se a lâmina atravessar uma bolha em vez do OCT ou do tecido, isso pode causar uma irregularidade ou rasgo e, consequentemente, destruir ou romper o tecido. Por isso, é essencial evitar essas bolhas a todo custo.

Os maiores especialmente. Então ainda estou posicionando-o aqui. Esse tecido foi fixado por 24 horas, portanto é bastante resistente às minhas manipulações.

O outro tecido pode ser um pouco mais macio, então você deve ser muito cuidadoso. Assim que posicioná-lo sob o microscópio com a face voltada para a esquerda e a parte superior da cabeça para cima, precisarei garantir que também esteja correto nos outros planos de orientação. Então, levantarei e observarei todas as faces do cubo para verificar se está adequado.

E vejo que está ligeiramente inclinado para baixo, então preciso apenas levantar com minha pinça. Está claro? E isso certamente exige muita prática. Está bem, parece bom.

Agora vou andar até aqui e congelá-lo em nitrogênio líquido. Ok, agora que o tecido está orientado corretamente no molde criogênico, vou despejar meu nitrogênio líquido nesta placa aqui. Esta é apenas uma placa de Petri plástica comum para cultura de tecidos, até a borda superior.

Evapora bastante rapidamente. Vou pegar minha pinça e abaixar o molde criogênico. E como você pode ver, na verdade, eu curvei a borda inferior.

Isso certamente permite um manuseio melhor, mais adequado. Vou congelá-lo. E conforme o tecido e o OCT congelam, eles ficam brancos sólidos.

E quando estiver completo, tudo ficará branco. Em seguida, preciso colocar rapidamente o tecido congelado no congelador a menos 80 para armazenamento. Você deve segurá-lo de modo que o tecido não fique submerso.

Portanto, você precisa ter muito cuidado para mantê-lo na superfície superior do nitrogênio líquido. Ok, agora está congelado. Mantenha-o ali por alguns segundos a mais antes de ir para o -80.

Ok, agora vou levá-lo ao congelador de menos 80. Peguei meu tecido do congelador de menos 80 e o coloquei neste criostato aqui. A câmara está efetivamente a menos 24 graus Celsius.

No momento, você precisa deixar o tecido em equilíbrio por cerca de meia hora a uma hora antes de iniciar o corte. Caso contrário, ele fica muito frágil. Embora todos os criostatos sejam diferentes, vou apenas destacar alguns aspectos básicos sobre esta máquina aqui.

Então usamos o Leica CM 30 50 s. É uma boa máquina porque possui uma unidade de refrigeração separada para o próprio espécime, o que é uma vantagem adicional interessante. Você pode ajustar a temperatura do espécime, e diferentes tecidos exigem temperaturas distintas para o corte.

Portanto, quando você carregar seu tecido pela primeira vez, precisará fazer vários ajustes. E estes são semelhantes em todos os criostatos. Estes são componentes eletrônicos, alguns deles operados manualmente.

Por exemplo, você precisará retrair o braço do criostato ou avançá-lo para posicioná-lo mais longe ou mais perto da lâmina. Você pode fazer isso rapidamente ou lentamente. É possível definir a espessura do corte usando este sinal de mais ou menos aqui.

E você selecionará entre o corte ou a espessura da seção, o que é indicado no botão central aqui. Em seguida, definirá a temperatura da câmara ou do próprio espécime próximo a este visor digital, simplesmente pressionando este botão e usando estas setas para cima ou para baixo para ajustar a temperatura. Então, para nós, quando realizamos crioseções, utilizamos lâminas de microscópio Fisherbrand Superfrost Plus.

Eles são revestidos com um adesivo para que o tecido não se desprenda durante o processamento. Às vezes, durante o corte, você notará que o tecido parece um pouco mole, e alguns sinais disso ocorrem quando ele atinge a lâmina e se acumula. O que pode ser usado para corrigir isso é o congelante superamigável da marca Fisher.

Ele, é, ele congela rapidamente o tecido e você simplesmente o direciona ao seu tecido e aperta o gatilho, o que fará com que o tecido seja rapidamente recongelado caso esteja muito mole. Antes de montar o tecido em um porta-bloco para o corte, gostaria de fazer uma rápida apresentação de alguns componentes da máquina aqui. Este é o local onde você realmente instala a lâmina, que é fixada com esta placa metálica.

Ao levantar este braço, você pode efetivamente remover e substituir a lâmina conforme necessário. Certifique-se de que ela esteja bem fixada. Não é recomendado apertar excessivamente a lâmina, pois isso pode deformá-la.

Você perceberá que, no seu corte, a espessura do tecido não é uniforme. Portanto, você não deve empurrar completamente este braço para baixo. Você deve apenas posicioná-lo de forma que fique aproximadamente alinhado com a lâmina em si.

Isso aqui é outra coisa que você pode precisar ajustar durante o corte. É chamado de placa anti-oscilação. É um pedaço de vidro que se encaixa neste suporte aqui e pode ser ajustado usando este parafuso com mola aqui.

E você basicamente move para frente ou para trás. E isso manterá seu tecido ou suas seções planas, de modo que você possa montá-las em uma lâmina. Outra coisa que você talvez queira ajustar durante o corte é o local na lâmina que está realizando o corte propriamente dito.

Então, como você faz esse ajuste? Basta levantar esta alavanca e deslizar todo este conjunto para a esquerda ou para a direita. Você utiliza isso apenas se notar que seu tecido está prendendo em uma determinada parte da lâmina ou se desejar economizar lâminas, pois elas são bastante caras. Assim, é possível encontrar uma área limpa e adequada movendo o conjunto para frente e para trás.

Outra coisa que você pode ajustar é o ângulo do corte. Agora, na lateral aqui, o que você não conseguirá ver, há três posições diferentes. Utilizamos apenas a posição central e você faz esse ajuste levantando esta outra alavanca.

E, e isso pode, você pode fazer esse aparato subir e descer. Nós sempre o mantemos no meio. Então, vou apenas mantê-lo assim agora.

Esta parte aqui atrás é a cabeça do criostato. Ela realmente segura o espécime de tecido congelado durante o seu corte. Ela se move para cima e para baixo e avança em direção à lâmina.

E basicamente você monta o tecido nesta pinça aqui e colocaremos a pinça na cabeça, apertaremos bem, e depois usaremos estes botões na parte traseira para ajustar o ângulo e obter um corte mais reto. Agora vou montar o tecido na pinça. Você deve manter as pinças em temperatura ambiente, porque primeiramente adicionará uma camada de OCT e não quer que ela congele imediatamente, pois é importante que fique uma camada bem plana.

E usaremos este dispositivo aqui para, é chamado de extrator de calor. Na verdade, será usado para nivelar o OCT enquanto ele congela. Então, o que faço primeiro é pegar a amostra à temperatura ambiente e colocá-la neste suporte aqui.

Coloque algumas das minhas bolhas de OCT. Não importa aqui porque elas serão expelidas. Basta adicionar um pouco, não é necessário muito.

Coloque o extrator de calor e deixe-o bem ali. Espere alguns segundos. E então você pode ver que o OCT está bem liso.

Agora tenho meu tecido e preciso marcar o OCT real. Ok, então vou marcar um ponto no OCT para indicar sua posição. Pronto, acabei de marcar o topo com um ponto azul.

Agora vou retirar o bloco de tecido do molde, fazendo isso simplesmente empurrando contra a parte traseira. Vou pressionar suavemente a parte de trás e empurrá-lo para minha mão, mas, novamente, não quero que ele descongele. Por isso, coloco-o de volta imediatamente.

Agora você pode ver o bloco de tecido com a marca azul que coloquei nele. Assim, sei que é a parte superior da cabeça do embrião. E quero fazer cortes pela face, porque esses são cortes coronais.

Agora, vou adicionar outra gota grande de OCT e preciso agir rapidamente, pois tudo está frio. Vou pegar meu tecido e colocá-lo bem no centro, certificando-me de que esteja plano contra a base de OCT já formada. Agora, deixarei que isso congele, o que levará cerca de um ou dois minutos.

Agora terminou a congelação. Vou pegar o tecido que está fixado no suporte, colocá-lo na cabeça do aparelho, alinhá-lo o máximo possível e, em seguida, apertar. Pode ficar bem firme.

Vou colocá-lo logo à frente da lâmina e depois avançar, o que pode levar vários segundos. Ok, agora vou usar a borda plana da lâmina para fazer um posicionamento fino do tecido. Então, simplesmente observo a borda e movimento o tecido para cima e para baixo apenas para garantir que as bordas estejam alinhadas.

Se eles não o fizessem, você sabe, poderia parecer algo assim. Obviamente estou exagerando, mas aqui dá para ver que não está reto em relação à lâmina. Então, continuo fazendo ajustes até sentir que está o mais reto possível.

Acho que está bem bom. Então, olho de todos os ângulos para garantir que o tecido será cortado diretamente contra a lâmina, e uso a borda da lâmina para indicar isso. Estou olhando de cima e de lado, e o tecido na verdade parece estar bem adequado.

Não preciso fazer muitos ajustes, mas, se precisasse, usaria apenas os botões localizados na parte traseira da cabeça. Ao girá-los para a esquerda ou para a direita, é possível ver que é possível fazer ajustes finos dessa maneira. Mas parece estar bem bom.

Agora, estou avançando o tecido. Ainda não está cortando, porque não está encostando na lâmina. O tecido está embutido profundamente no OCT.

Portanto, pode levar vários minutos para atingir o tecido. Você não deve ir muito rápido porque pode prender e rachar o OCT e o seu tecido, mas também não deve ir muito devagar, pois pode levar uma eternidade. Há uma função útil nesta máquina em que é possível realizar um corte de desbaste com uma secção mais espessa, o que permitirá avançar mais rapidamente.

Agora estou, na verdade, cortando o OCT, então estou diminuindo um pouco a velocidade. Ainda não cheguei ao tecido, mas este é o momento em que avalio como o seccionamento irá prosseguir. Muitas variáveis podem fazer com que o seccionamento do seu tecido ocorra muito bem ou muito mal.

O que mais acontece com este criostato é que o tecido está, na verdade, um pouco muito frio. Eu reduzi a temperatura, mas ainda parece que está um pouco frio demais. E o que acontece é que a lâmina vibra ao passar pelo tecido ou pelo OCT.

Então você obterá essas pequenas linhas, essas linhas horizontais através do OCT. O que faço é usar meu polegar para aquecer levemente a borda, aquecendo o OCT apenas tocando-o suavemente e deslizando meu polegar, mas por pouco tempo. E então, quando faço o corte, percebo que os cortes saem muito melhores e o tremor cessou.

Então, esses são os tipos de aspectos que avalio antes de chegar ao tecido. Observei que, quando a lâmina avança pelo tecido, ocorre um travamento ou, na verdade, uma rachadura no OCT. Uma das primeiras medidas que tomo é trocar a lâmina.

Não tenho certeza de quanto tempo esta lâmina está aqui nem quem a usou antes de mim, então vou apenas pegar uma lâmina nova. Elas são muito afiadas, obviamente, então é preciso ter cuidado. Vou ajustar a placa anti-rolamento e há um parafuso com mola na parte inferior aqui que você precisa alcançar por baixo e pode movê-lo para dentro ou para fora.

Então, avancei e seccionei o suficiente para já estar no tecido. E, infelizmente, há uma rachadura atravessando o bloco de OCT, o que acontece com frequência e, infelizmente, não é possível controlá-la completamente, mas existem medidas que podem ser tomadas para corrigi-la. Se a rachadura tivesse atravessado o tecido, seria necessário descartar a amostra ou tentar recuperar o máximo possível.

Neste caso, a rachadura parece estar acima do tecido. Então, o que vou fazer é pegar uma lâmina de barbear que esteve dentro do criostato. Está, está gelada.

E vou tentar remover apenas a parte rachada, que está no topo do bloco de OCT. Então, novamente, usarei meu polegar para aquecer a superfície do bloco de OCT. Em seguida, farei cortes e, se puder ver aqui, está rachado.

Então, retirei o pedaço com o tecido e depois o restante do OCT, que simplesmente joguei fora, pois era a parte rachada. O que vou fazer agora é tentar aparar essa parte rachada usando uma lâmina de barbear gelada. Preciso cortar em linha reta e usar ambas as mãos, aplicando pressão uniforme sobre a lâmina.

E vou mover a lâmina de vai e vem no OCT. Estou movendo de volta e adiante, cortando lentamente no OCT. Espero estar removendo a parte trincada.

Certo, vou cortar removendo esse excesso de OCT. Tudo bem, parece bom. Em seguida, vou retrair levemente a cabeça, pois criei bordas que podem prender na lâmina, e, se isso acontecer, pode quebrar o OCT e o tecido, o que estragaria minha amostra.

Então, recuei, então precisarei avançar um pouco mais para voltar ao tecido e, espero, corrigir a fissura. Está bem, agora estou voltando ao tecido. Está bem, parece que consegui corrigi-la.

Portanto, não há mais quaisquer rachaduras no OCT, o que tornará a captura das seções muito mais fácil. Agora vou avançar até a parte do tecido que me interessa. Neste momento, estou apenas atingindo a superfície e gostaria de penetrar no cérebro deste embrião.

Esses são grandes o suficiente para que eu realmente consiga ver as estruturas em que estou interessado. Deixei de mencionar que uso essas escovas para limpar a lâmina entre cada corte que vou capturar. Este maior é apenas para limpar a área e remover o excesso de OCT.

Também uso essas escovas mais finas para manipular o corte contra esta placa fria aqui, a fim de posicioná-lo ao capturá-lo no corte. Novamente, essas escovas são mantidas frias, para que o OCT não derreta e adira às escovas. Para capturar o tecido, primeiro vou aquecer o OCT e o tecido com o polegar.

E vou pegar um desses lâminas que já etiquetei. Eu a seguro de cabeça para baixo e cada um faz isso de um jeito. Mas a maneira como faço é segurar este canto superior direito, quando a lâmina está voltada para baixo, com a minha mão direita.

Em seguida, uso o polegar esquerdo como ponto de pivô para descer diretamente contra a lâmina e capturar o corte. O OCT e o tecido realmente derreterão sobre a lâmina e se montarão por si mesmos. Primeiro, aqueço lentamente o tecido com o polegar, realizo o corte, pego a lâmina, seguro o canto direito com a mão direita, movo a placa, abaixo-a diretamente e deixo que derreta.

Vou examinar o tecido para garantir que não há dobras ou bolhas e que está com boa aparência. E continuarei fazendo isso até seccionar completamente todo o cérebro. Agora estou observando os cortes ao microscópio estereoscópico para verificar se estão com boa aparência, e estão; é possível ver o prosencéfalo na parte superior do corte, e todos parecem muito bons.

Você pode usar essas seções criogênicas para coisas como hibridização in situ. Às vezes fazemos histologia básica, colorações com hematoxilina e eosina. Você também pode realizar imunofluorescência e, sabe, diversos ensaios desse tipo.

Para mim, em particular, essas secções foram fixadas e processadas para hibridização in situ. Portanto, é isso que farei a seguir.