Name: Flash Freezing e Cryosectioning E12.5 cérebro de camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 32 s
Description: Aprenda técnicas de congelamento rápido e crioseccionamento de cérebro embrionário de camundongo E12.5 usando OCT e criostato. Este método demonstra como obter secções de tecido livres de distorções para análises em neurociência.

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<ol><li> Fix tecido em paraformaldeído 4% em PBS para o tempo desejado. </li><li> Tecido sacarose infundir (crioproteção) <ol><li> Fazer solução de sacarose 30% em PBS w / v em 2059 tubo. </li><li> Enxaguar tecido em 3x PBS (~ 5 min com balanço). </li><li> Tecido lugar em solução de sacarose 30%. Tecido não vai afundar. </li><li> Coloque o tecido em 4 ° C durante a noite, ou até que tenha afundado. </li></ol></li><li> Tamanho da etiqueta apropriada cryomold com informação e orientação. </li><li> Preencha cryomold com outubro (evitar bolhas). </li><li> Transferência de tecido para outubro de banho e bata-a com outubro </li><li> Transferência de tecido para outubro em cryomold. </li><li> Orientar o tecido sob o microscópio. </li><li> Despeje nitrogênio líquido em placa de Petri de plástico. </li><li> Rápida e cuidadosamente inferior do tecido em cryomold no nitrogênio. (Não submergir o topo da cryomold.) </li><li> Quando o OCT é sólido branco, coloque o tecido congelado em freezer -80 ° C para armazenamento. </li><li> Equilibrar tecido para ~ 20 ° C por pelo menos 30 min. antes do corte. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Molde de criotomia Tissue-Tek</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27050</td><td></td></tr><tr><td>Solução de sacarose</td><td></td><td></td><td>Solução de sacarose a 30% em PBS, peso/volume</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td></td><td></td><td>Paraformaldeído a 4% em PBS</td></tr></tbody></table>

flash freezing e cryosectioning e12.5 cérebro de camundongo

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

<p class="jove_content">Demonstrado neste vídeo são as técnicas de congelamento instantâneo e secção tecido cerebral embrionário de rato. Dicas úteis para usar o criostato são dadas, incluindo métodos de solução de problemas que podem ser usados ​​durante o corte para garantir que as seções resultantes tecidos estão livres de rachaduras e outras distorções.</p>

Flash Freezing e Cryosectioning E12.5 cérebro de camundongo

<p>Olá, sou Spencer Curley da Universidade da Califórnia em Irvine e do laboratório de Ed Maki, e vou demonstrar como realizar a criosseção. Para isso, utilizo primeiramente estes reagentes comumente usados. O composto de inclusão ou meio de inclusão que utilizo é chamado OCT, que significa temperatura ideal para corte.</p><p>É uma solução transparente, muito espessa e viscosa, que mantém bem o tecido enquanto você o orienta, e depois congela. Além disso, é solúvel em água, de modo que pode ser removida durante qualquer procedimento de coloração. Então, incluo o tecido em um molde. Esses recipientes para biópsia em moldes criogênicos estão disponíveis em vários tamanhos.</p><p>Vou usar este molde menor aqui porque trabalho com tecido embrionário de camundongo. Congelamos rapidamente nosso tecido em nitrogênio líquido. Então, primeiro vou encher este frasco de vácuo de proteção com nitrogênio líquido do nosso tanque aqui.</p><p>Antes de congelar rapidamente o tecido, é necessário fazer o que se chama de crioproteção do tecido; caso contrário, o congelamento em si destruirá o tecido. Para isso, mergulha-se o tecido em uma solução de sacarose a 30% durante a noite. Se levar mais tempo, não há problema, desde</p>

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a criopreservação do cérebro de um camundongo para isolar áreas anatômicas discretas ou populações de células específicas dos tecidos tumorais. Esta técnica é fundamental para obter a resolução óptica ideal da morfologia do tecido cerebral para análise subsequente.

Criopreservação de cérebro murino por congelamento instantâneo: uma técnica para congelar rapidamente espécimes de cérebro de camundongos inteiros para análise histológica

Neste vídeo, demonstramos o seccionamento de um tecido tumoral cerebral de camundongo congelado usando um criostato. As seções de tecido cerebral congeladas assim obtidas são armazenadas em baixas temperaturas até uma análise posterior.

Seccionamento de tecido cerebral de camundongo congelado: um procedimento para obter seções finas de tecido congelado de tecido cerebral murino congelado

Este vídeo demonstra um protocolo passo a passo detalhado para preparar seções congeladas de tecido cerebral de camundongo para análises a jusante.

Processamento de um cérebro de camundongo para análise a jusante

Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.

Combinando Hibridização <em>In Situ</em> por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

Um método conveniente de perfusão alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato é apresentado. A detecção imunofluorescente de α-sinucleína fosfoilada é demonstrada em um modelo de camundongo da doença de Parkinson. Este trabalho também descreve de forma abrangente as etapas de perfusão transcárdia, dissecção, congelamento/incorporação de tecidos e etapas de secção congelada.

Um método de perfusão transcárvia alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato

O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.

Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.

Crioseccionamento direto de cabeças de <em>Drosophila</em> para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

<em>En face</em> Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Esse protocolo padroniza a criotomografia eletrônica (crio-ET) para tecidos espessos, integrando congelamento de alta pressão (HPF) com o método waffle, levantamento por feixe de íons de foco criogênico (crio-FIB) e aquisição paralela e dose-simétrica, resultando em lamelas uniformemente finas e amostras vitrificadas para análise in situ reprodutível no hipocampo do camundongo.

Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

Aprenda técnicas de congelamento rápido e crioseccionamento de cérebro embrionário de camundongo E12.5 usando OCT e criostato. Este método demonstra como obter secções de tecido livres de distorções para análises em neurociência.

Flash Freezing e Cryosectioning E12.5 cérebro de camundongo

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