Flash Freezing e Cryosectioning E12.5 cérebro de camundongo

Olá, sou Spencer Curley, da Universidade da Califórnia em Irvine e do Ed Maki's Lab, e vou demonstrar como fazer criossecção. Para fazer isso, eu uso esses reagentes comumente usados primeiro. O composto de incorporação ou mídia de incorporação que eu uso é chamado de OCT para temperatura de corte ideal.

É uma solução transparente, é muito espessa e viscosa, e segura bem o tecido enquanto você pode orientá-lo e depois congela e, finalmente, é solúvel em água para que você possa se livrar dele durante qualquer tipo de procedimento de coloração. Então eu incorporo o tecido em um molde. Esses recipientes de biópsia de molde criogênico vêm em vários tamanhos.

Vou usar esse molde menor aqui porque faço tecido embrionário de camundongo. Nós congelamos rapidamente nosso tecido e nitrogênio líquido. Então, primeiro vou encher esse frasco de vácuo protetor com nitrogênio líquido do nosso tanque aqui.

Antes de congelar o tecido, você deve proteger o tecido, caso contrário, o congelamento em si destruirá o tecido. Então, o que você faz é afundar o tecido em uma solução de sacarose a 30% durante a noite. E se demorar mais, tudo bem, desde que o tecido afunde.

E como você pode ver, as cabeças de camundongos do dia 12.5 embrionárias do visto estão afundadas na solução de sacarose, então estão prontas para serem congeladas. Então agora vou simplesmente derramar o tecido que está em uma solução de sacarose em um prato maior que eu, para que eu possa manipular o tecido. Vou pegar um pouco dessa OCT e despejá-la neste prato de 35 milímetros que na verdade está apoiado na tampa para que eu possa colocá-lo em ângulo.

Assim, o OCT se acumula ao longo da borda para obter profundidade. Então, estou usando um par de pinças embotadas mais antigas simplesmente porque você não precisa que elas sejam afiadas e não quer estragar outro par de pinças. Então eu, eu os pego e levanto uma dessas cabeças com muito cuidado, e coloco-a neste primeiro banho de OCT.

Eu só quero revestir o embrião em OCT. Isso permite um congelamento melhor e mais uniforme do tecido. Você não quer nenhuma sacarose residual ao redor do tecido ou bolhas de ar.

Definitivamente, evite bolhas de ar. Então, estou mexendo suavemente a OCT ao redor e sob a cabeça, movendo, movendo a cabeça através da OCT e deixando-a descansar por apenas alguns segundos enquanto encho meu molde criogênico. Então agora vou preencher o molde criogênico com a OCT, novamente, evitando bolhas.

E eu vou preenchê-lo até o topo do molde. E como você notará, eu rotulei o molde. Então eu vou, poderei ver minha orientação depois que ela estiver congelada.

Quando a OCT congela, ela fica branca e você não pode mais ver seu tecido. Então, você definitivamente quer rotular em um marcador permanente. O, o molde criogênico.

Na verdade, eu peguei uma bolha no, na OCT, então vou usar minha pinça para empurrá-la para fora da borda. Você não quer que isso interfira no seu congelamento do tecido. Então, agora vou transferir a cabeça deste prato para a OCT que está no meu molde.

Vou retirá-lo do prato e colocá-lo no molde com muito cuidado. Então eu vou para o microscópio onde vou orientar o tecido. Eu tenho o tecido no meu molde criogênico aqui e vou olhar através do escopo para poder orientá-lo.

Vou fazer seções coronais através dessa cabeça de rato. Portanto, preciso orientá-lo para poder posicioná-lo no criostato para cortes coronais. Então, novamente, estou usando essas velhas pinças embotadas e, como você pode ver, há algumas bolhas aqui e vou tentar o meu melhor para tirá-las.

Mas essas bolhas menores não são, não são ruins. Não notei nada com essas bolhas menores. Você simplesmente não quer bolhas grandes.

Então, vou retirá-los da melhor maneira possível e definitivamente limpar o fórceps com frequência, porque você pode evitar bolhas melhor dessa maneira. E agora, se você puder ver minha rotulagem, eu tenho um t aqui no topo e um F à minha esquerda aqui. Isso só me indica que a cabeça, o topo da cabeça vai ficar para cima e a frente ou o rosto vai ficar à minha esquerda.

Dessa forma, sei por qual superfície seccionar para seções coronais e estou apenas cutucando o tecido. E, novamente, às vezes isso introduz bolhas e você só quer empurrá-las para fora para que não congelem junto com o tecido. Portanto, é ruim ter bolhas, principalmente porque quando você está congelando, as bolhas de tecido podem causar congelamento inconsistente.

O objetivo do congelamento instantâneo é ter tudo congelado de uma vez. Além disso, quando você está, quando você está cortando o tecido e o criostato, o, se a lâmina passar por uma bolha em vez da OCT ou do tecido, pode causar um obstáculo ou um rasgo e, e destruir ou, você sabe, quebrar seu tecido. Então você definitivamente quer evitar essas bolhas a todo custo.

Os maiores, especialmente. Então, eu ainda estou orientando isso aqui. Este tecido foi fixado por 24 horas, por isso é bastante resistente às minhas manipulações.

Outro tecido pode ser um pouco mais macio, então você só quer ser muito gentil. Então, uma vez que eu o tenha posicionado sob o escopo com a face voltada para a esquerda e a parte superior da cabeça para cima, vou precisar ter certeza de que está correto em outros planos de orientação também. Então, vou levantar e examinar todas as faces do cubo para ter certeza de que está certo.

E eu vejo que está ligeiramente inclinado para baixo, então eu tenho que levantar com meu fórceps. Okey? E isso definitivamente requer muita prática. Ok, parece bom.

Agora vou caminhar até aqui e congelá-lo em nitrogênio líquido. Ok, agora que o tecido está orientado corretamente no molde criogênico, vou derramar meu nitrogênio líquido neste prato aqui. Esta é apenas uma placa de Petri de plástico normal para cultura de tecidos até o topo.

Ele evapora muito rapidamente. Vou pegar minha pinça e abaixar o molde criogênico. E como você pode ver, eu realmente dobrei o lábio inferior.

Isso definitivamente permite um manuseio melhor, melhor. Vou congelá-lo. E à medida que o tecido e a OCT congelam, ele fica branco sólido.

E quando estiver completo, tudo ficará branco. E então eu tenho que colocar rapidamente o tecido congelado no freezer de menos 80 para armazenamento. Você quer segurá-lo de forma que o tecido não fique submerso.

Portanto, você deve ter muito cuidado apenas para segurá-lo na superfície superior do nitrogênio líquido. Ok, agora está congelado. Segure-o por alguns segundos extras antes de eu ir para o menos 80.

Ok, agora vou levá-lo para menos 80. Então eu peguei meu tecido do menos 80 e coloquei neste criostato aqui. A câmara está na verdade com 24 graus Celsius negativos.

Agora você tem que deixar o tecido se equilibrar por cerca de meia hora a uma hora antes de começar a seccionar. Caso contrário, é muito quebradiço. Portanto, embora todas as estatísticas criogênicas sejam diferentes, vou apenas apontar algumas das coisas básicas sobre essa máquina aqui.

Então usamos o Leica CM 30 50 s. É uma boa máquina porque possui uma unidade de resfriamento separada para a própria amostra, o que é um bom benefício adicional. Você pode definir a temperatura da amostra e tecidos diferentes requerem temperaturas diferentes para o corte.

Então, quando você carrega seu tecido pela primeira vez, precisa fazer vários ajustes. E estes são semelhantes em todas as estatísticas criogênicas. Estes são eletrônicos, alguns deles são operados manualmente.

Por exemplo, você precisará retrair o braço do criostato ou avançá-lo para posicioná-lo mais ou mais perto da lâmina. Você pode fazer isso rápido ou lento. Você pode definir a espessura do seu corte com, com esse sinal de mais ou menos aqui.

E você selecionará entre a espessura do corte ou da seção, que é indicada no botão do meio aqui. Você definirá a temperatura da câmara ou da própria amostra ao lado deste display digital simplesmente pressionando-o e usando essas setas para cima ou para baixo para ajustar a temperatura. Então, para nós, quando fazemos criossecção, usamos essas geadas Super da marca fish fisher mais lâminas de microscópio.

Eles são revestidos com algum adesivo para que o tecido durante o processamento não saia. Às vezes, durante o seccionamento, você notará que o tecido parece um pouco macio e algumas indicações disso serão se ele atingir a lâmina e se amontoar. E o que você pode usar para consertar isso é esse congelamento super amigável da marca Fisher.

É, ele congela rapidamente o tecido e você apenas o aponta para o tecido e pressiona o gatilho e ele congela rapidamente o tecido se estiver muito mole. Antes de montar o tecido em um mandril para seccionamento, gostaria de levá-lo a um rápido tour por algumas das coisas na máquina aqui. Então é aqui que você realmente carrega a lâmina, que é presa com essa placa de metal.

Ao puxar este braço, você pode remover e substituir a lâmina conforme necessário. Certifique-se de que é bom e seguro. Você não quer prender demais a lâmina, caso contrário, ela realmente fica deformada.

E você notará em seu seccionamento que a espessura do tecido não é, não é consistente. Então você quer, você não quer empurrar esse braço totalmente para baixo. Você quer apenas levá-lo para onde está, mesmo com a própria lâmina.

Isso aqui é outra coisa que você pode ter que ajustar durante o seccionamento. É chamado de placa estabilizadora. É um pedaço de vidro que se encaixa neste suporte aqui e você pode ajustá-lo usando este parafuso com mola aqui.

E você basicamente o move para frente ou para trás. E isso manterá seu tecido ou suas seções planas para que você possa montá-los em uma lâmina. Outra coisa que você pode ajustar durante o corte é o local na lâmina que está fazendo o corte real.

Então, como você ajusta isso, basta levantar essa alavanca e deslizar toda essa engenhoca para a esquerda ou para a direita. E você só usa isso realmente se perceber que seu tecido está preso em uma determinada parte da lâmina ou se quiser economizar lâminas porque elas são bastante caras. Assim, você pode encontrar uma área limpa e agradável apenas movendo-a para frente e para trás.

Outra coisa que você pode ajustar é o ângulo de corte. Agora, ao lado aqui, que você não poderá ver, existem três posições diferentes. Nós apenas usamos a posição do meio e você a ajusta levantando essa outra alavanca.

E, e isso pode, você pode fazer essa engenhoca subir e descer. Nós sempre o mantemos no meio. Então, vou continuar assim agora.

Então, isso aqui é a cabeça do criostato. Na verdade, ele conterá a amostra de tecido congelado enquanto ela está sendo seccionada. Ele balança para cima e para baixo e avança em direção à lâmina.

E basicamente você monta o tecido neste mandril aqui e nós colocamos o mandril na cabeça, apertamos e depois usamos esses botões na parte de trás para ajustar o ângulo para torná-lo um corte mais reto. Então, agora vou montar o tecido no mandril. Você quer manter os mandris em temperatura ambiente porque primeiro adicionará uma camada de OCT e não quer que ela congele imediatamente porque quer que seja uma boa camada plana.

E usaremos essa engenhoca aqui para um, é chamado de extrator de calor. Na verdade, ele será usado para achatar a OCT enquanto ela congela. Então, o que eu faço primeiro é verificar a temperatura ambiente e colocá-la neste suporte aqui.

Pegue algumas das minhas bolhas de OCT. Não importa aqui porque eles serão espremidos. Basta adicionar um, um pouco, não você não precisa de muito.

Pegue o extrator de calor e coloque-o bem lá embaixo. Aguarde alguns segundos. E então você pode ver que a OCT é bonita e plana.

Então agora eu tenho meu tecido e preciso marcar a OCT real. Ok, então vou marcar um ponto na OCT para indicar sua posição. Então, acabei de marcar o topo com um ponto azul.

Então agora vou tirar o bloco de tecido do molde e fazer isso apenas empurrando a parte de trás dele. Então, vou empurrar as costas com cuidado e empurrá-las na minha mão, mas, novamente, não quero que descongele. Então eu coloquei de volta.

Então agora você pode ver o bloco de tecido com a marca azul que eu coloquei nele. Então eu sei que é o topo da cabeça do embrião. E eu quero seccionar o rosto porque essas são seções coronais.

Então, agora o que vou fazer é adicionar outra gota de gota grande OCTA, e tenho que agir rapidamente agora porque tudo está frio. E eu vou pegar meu lenço de papel e colocá-lo bem no meio, certifique-se de que esteja plano contra a cama de OCT já feita. Agora vou deixar isso congelar e isso levará cerca de um ou dois minutos.

Então agora terminou de congelar. E eu vou, pegar o tecido que está montado no mandril, colocá-lo na cabeça, deixá-lo o mais reto possível e depois apertar. Pode, é bom e apertado.

Vou colocá-lo bem na frente da lâmina e depois avançá-lo, o que pode levar vários segundos. Ok, agora vou usar a borda plana da lâmina para realmente fazer o posicionamento preciso do tecido. Então, eu simplesmente vou olhar para a borda e balançar o tecido para cima e para baixo apenas para ter certeza de que as bordas se alinham.

Se não o fizessem, você sabe, poderia ser algo assim. Estou exagerando, obviamente, mas você pode ver aqui que não é direto contra a lâmina. Então, continuo fazendo ajustes até sentir que está o mais reto possível.

Eu acho isso muito bom. Então, eu olho de todos os ângulos para ter certeza de que o tecido vai cortar diretamente contra a lâmina e eu uso a borda da lâmina para indicar isso. Então, estou olhando para cima e olhando de lado e o tecido realmente parece muito bom.

Não preciso fazer muitos ajustes, mas se o fizesse, usaria apenas os botões que estão na parte de trás da cabeça. E girando para a esquerda ou para a direita, você pode ver que pode fazer ajustes finos dessa maneira. Mas parece muito bom.

Agora, eu estou, eu estou realmente avançando o tecido. É, ainda não está cortando porque não é contra a lâmina. O tecido está embutido profundamente na OCT.

Portanto, pode levar vários minutos para chegar ao tecido. Você não quer ir muito rápido porque pode pegar e quebrar a OCT e seu tecido, mas você também não quer ir muito devagar porque pode demorar uma eternidade. Há uma boa função nesta máquina onde você pode fazer um corte em uma seção mais grossa, o que permitirá que você vá mais rápido.

Então, agora eu estou, na verdade, estou cortando a OCT agora, então estou desacelerando um pouco. Então, ainda não cheguei ao tecido, mas este é o momento em que avalio como vai ser o seccionamento. Muitas variáveis podem fazer com que o seu corte de tecido corra muito bem ou muito mal.

O que eu acho que acontece com mais frequência com esse criostato é que o tecido é na verdade um pouco frio demais. Eu reduzi a temperatura, mas ainda parece que está um pouco frio demais. E o que acontece é que a lâmina vai vibrar através do, através do tecido ou, e através da OCT.

Então você obterá essas pequenas linhas, essas linhas horizontais através do, através da OCT. O que eu faço é pegar meu polegar e simplesmente aquecer a borda, aquecer a OCT apenas tocando-a suavemente, deslizando meu polegar, não por muito tempo. E então, quando eu o seciquei, percebi que eles saíram muito melhor e a conversa parou.

Então, esses são os tipos de coisas que eu vou, eu vou, eu vou avaliar antes de chegar ao tecido. Então, notei que, à medida que a lâmina atravessa o tecido, há um obstáculo ou, ou rachadura, na verdade, na OCT. Então, uma das coisas que eu faço primeiro é trocar a lâmina.

Não tenho certeza de quanto tempo essa lâmina está aqui e quem a usou antes de mim, então vou seguir em frente e pegar uma nova lâmina. Estes são muito afiados, obviamente, então você tem que ter cuidado. Então, vou ajustar a placa estabilizadora e há um parafuso com mola na parte inferior aqui que você só precisa alcançar por baixo e pode movê-lo para dentro ou para fora.

Então, avancei e seccionei o suficiente para que agora eu esteja no tecido. E, infelizmente, há uma rachadura no bloco de OCT, que acontece com frequência e, infelizmente, você não pode realmente controlá-la, mas há coisas que você pode fazer para corrigi-la. Se a rachadura atravessou o tecido, você deve descartar a amostra ou tentar salvar o que puder.

Nesse caso, a rachadura parece estar acima do tecido. Então, o que vou fazer é pegar uma lâmina de barbear que está no criostato. É, é gelado.

E vou tentar cortar a parte rachada, que está no topo do bloco OCT. Então, novamente, vou usar meu polegar para aquecer a face do bloco OCT. E então eu vou secionar, e se você puder vê-lo aqui, está rachado.

Então lá eu tirei a peça com o lenço de papel e depois o resto da OCT de outubro que acabei de jogar, era a parte rachada. Então, o que vou fazer é tentar aparar essa parte rachada usando uma lâmina de barbear gelada. Eu tenho que ir muito reto e tenho que usar as duas mãos e aplicar pressão uniformemente na lâmina.

E eu vou balançar a lâmina para frente e para trás na OCT. Então, estou balançando para frente e para trás, cortando lentamente na OCT. Espero estar removendo a parte rachada.

Ok, vou reduzir a remoção desse excesso de OCT. Ok, parece bom. Em seguida, vou retrair um pouco a cabeça porque criei bordas que podem prender a lâmina e, se isso acontecer, pode realmente quebrar a OCT e o tecido e arruinar minha amostra.

Então eu me retraí, então vou precisar avançar um pouco mais para voltar ao tecido e espero ter corrigido a rachadura. Ok, agora estou voltando para o tecido. Ok, parece que eu, eu corrigi.

Portanto, não há mais rachaduras na OCT que tornem a captura das seções muito mais fácil. Então, agora vou avançar para a parte do tecido em que estou interessado. Neste momento, estou, estou chegando à superfície e gostaria de entrar no cérebro deste embrião.

Eles são grandes o suficiente para que eu possa realmente ver as estruturas nas quais estou interessado. Não mencionei que uso esses pincéis para limpar a lâmina entre cada seção que vou capturar. Este grande é apenas para limpar a área e remover o excesso de OCT.

Eu também uso esses pincéis mais finos para manipular a seção contra essa placa fria aqui para posicioná-la quando estou capturando-a na seção. Novamente, eles são mantidos frios, para que a OCT não derreta e grude nas escovas. Então, para capturar o tecido, vou primeiro aquecer a OCT e o tecido com o polegar.

E vou pegar um desses slides que já rotulei. Eu o seguro de cabeça para baixo e todo mundo faz isso de maneira diferente. Mas a maneira como eu faço isso é que gosto de segurar esse canto superior direito quando o slide está voltado para baixo com a mão direita.

E então use meu polegar esquerdo como ponto de pivô para que eu possa ir direto para baixo contra a placa e capturar a seção. A OCT e o tecido realmente derreterão contra o slide e se montarão. Então, primeiro vou aquecer o tecido com o polegar lentamente seccionado, pegar meu slide, segurar o canto direito com a mão direita, mover a placa, abaixá-la para baixo, deixá-la derreter.

Vou olhar para o tecido para ter certeza de que não há dobras ou bolhas e parece bom. E vou continuar fazendo isso até que eu divida todo o cérebro. Agora estou olhando para as seções através do escopo de dissecação para ter certeza de que elas têm uma boa aparência e têm, você pode ver o prosencéfalo no topo da seção e todas elas parecem muito bonitas.

Você pode usar essas seções criogênicas para coisas como hibridização in situ. Às vezes fazemos histologia básica, colorações h e e. Você também pode fazer imunofluorescência e, você sabe, vários ensaios como esse.

Para mim, em particular, essas seções foram fixadas e processadas para hibridização in situ. Então é isso que farei a seguir.