Name: Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a preparar células S2 de Drosophila para microscopia de luz usando lectina ConA e imunomarcação. Este protocolo facilita a visualização de estruturas celulares e análise funcional de genes.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional do Câncer P30 CA23074, a American Cancer Society Research Grant Institucional 74-001-31, ea Univ. do Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para o campo de biologia celular, um sistema ideal seria barato de manter, fácil de manipular, e passíveis de uma variedade de técnicas. Células Drosophila S2 satisfazer essas exigências, e assim eles tornaram-se rapidamente o sistema de escolha para um crescente número de celular laboratórios de biologia. Nós apresentamos um breve resumo dos métodos para preparar células S2 para microscopia. Uma virtude notável de células S2 é o fato de que eles crescem bem em atmosfera normal e te...

<table><tbody><tr><td>Células S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>DGRC</td><td>número de estoque 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>meio livre de soro</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>meio livre de soro</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>meio livre de soro</td></tr><tr><td>Meio Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Adicione 10% (final) de FBS inativado pelo calor para obter o meio completo.</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inativado pelo calor</td></tr><tr><td>Solução antibiótica 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contém penicilina (10000 U/mL),&lt;br/&gt;estreptomicina (10000 &amp;#x03BC;g/mL) e&lt;br/&gt;anfotericina B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>solução a 32%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anidro, grau ACS</td></tr><tr><td>Peneiras moleculares</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>tipo 3A</td></tr></tbody></table>

preparação de drosophila células s2 para microscopia de luz

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

O sistema experimental ideal seria barato e fácil de manter, passíveis de uma variedade de técnicas, e seria apoiado por uma extensa literatura e banco de dados seqüência do genoma. Células cultivadas Drosophila S2, o produto de embriões disassociated 20-24 horas de idade 1, possui todas essas propriedades. Conseqüentemente, as células S2 são extremamente bem adaptados para a análise de processos celulares, incluindo a descoberta de genes que codificam os componentes moleculares do processo ou mecanismo de interesse. As características de células S2 que são mais responsáveis ​​pela sua utilidade é a facilidade com que eles sejam mantidos, a sua sensibilidade apurada para double-stranded (ds) RNA de interferência mediada (RNAi), e sua docilidade para microscopia de fluorescência como ao vivo ou fixo células. Células S2 podem ser cultivadas em uma variedade de meios, incluindo uma série de baixo custo, disponíveis comercialmente, totalmente definido, sem soro media 2. Além disso, eles crescem de forma otimizada e rapidamente a 21-24 ° C e podem ser cultivadas em uma variedade de recipientes. Ao contrário das células de mamíferos, as células S2 não necessitam de um ambiente regulado, mas sim fazer o bem com o ar normal e pode até mesmo ser mantido em frascos lacrados. Complementando a facilidade de RNAi em células S2 é a capacidade de analisar rapidamente fenótipos experimentalmente induzida por fase ou microscopia de fluorescência de células fixas ou ao vivo. Células S2 crescer em cultura como uma monocamada única, mas não exibem inibição por contato. Em vez disso, as células tendem a crescer em colônias nas culturas densas. Em baixa densidade, culturas S2 cultivadas em vidro ou plástico da cultura de tecidos tratados são redondos e fracamente ligados. No entanto, a citologia de células S2 pode ser muito melhorada, induzindo-os a se achatar extensivamente através da cultura brevemente as sobre uma superfície revestida com a lectina, concanavalina A (ConA) 3. Células S2 também pode ser estavelmente transfectadas com marcadores fluorescentes marcadas para estruturas rótulo ou organelas de interesse em células vivas ou fixos. Portanto, o cenário habitual para a análise microscópica de células é esta: primeiro, as células S2 (que pode possuir para expressar transgenes marcadores marcados) são tratados por RNAi para eliminar uma proteína-alvo (s). RNAi tempo de tratamento pode ser ajustado para permitir que as diferenças em proteína turn-over cinética e para minimizar o trauma celular / morte, se a proteína-alvo é importante para a viabilidade. Em seguida, as células tratadas são transferidos para um prato contendo uma lamela pré-revestida com ConA para induzir as células a se espalhar e firmemente aderem ao vidro. Finalmente, as células são gravadas com a escolha do pesquisador de modos de microscopia. Células S2 são particularmente bons para estudos que necessitem de visualização alargado de células vivas uma vez que estas células se manter saudável à temperatura ambiente e atmosfera normal.

Drosophila Schneider (S2), as células são um sistema cada vez mais popular para a descoberta e análise funcional de genes. Nosso objetivo é descrever algumas das técnicas microscópicas que formam células S2 tal sistema cada vez mais importante experimental.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

O sistema experimental ideal seria barato e fácil de manter, adaptável a uma variedade de técnicas e seria respaldado por uma literatura extensa...

O objetivo geral deste procedimento é descrever o preparo de células S de Drosophila para microscopia de luz. Isso é realizado primeiramente preparando-se placas de cultura com fundo de vidro. O segundo passo do procedimento consiste em revestir o fundo de vidro com a lectina conval.A para promover a adesão e achatamento das células S dois. O terceiro passo do procedimento é adicionar meio de cultura e células S dois à placa de cultura. O passo final do procedimento é fixar e imunomarcar as células S dois na placa de cultura.No final, podem ser obtidos resultados que mostram a localização de proteínas de interesse marcadas com fluoro quatro ou por imunomarcação por meio de microscopia de fluorescência de células S dois vivas ou fixadas, respectivamente. Olá, sou Joey Club do laboratório de Greg Rogers, do Departamento de Biologia Celular e Anatomia da Universidade do Arizona. Sou John Nye, também do Laboratório Rogers.E eu sou Dan Buster, também. Estou no laboratório de Greg Rogers. Hoje vamos mostrar um procedimento para preparar células S2 de Drosophila para microscopia de luz.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a regulação da duplicação centriolar em D

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Research

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Biology

Biologia

Um método simples, barato e eficaz de preparação de embriões de Drosophila live-imaging análise é apresentada. Nosso protocolo fornece umidade e as trocas gasosas e não comprimir o embrião de Drosophila. Este método é adequado para GFP baseada em imagens ao vivo de embriões Drosophila usando um estereomicroscópio ou microscópio composto vertical.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

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Células Drosophila S2 e neurônios cultivados são grandes sistemas para a imagem latente de transporte organela motorizado in vivo. Aqui nós descrevemos protocolos detalhados para o cultivo de ambos os tipos de células, a sua imagem e análise de transporte.

Transporte Organelle em Cultivadas Drosophila Células: Linha celular S2 e primário neurônios.

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

SEM análise é um método eficaz para auxiliar na identificação de espécies ou discriminação fenotípica. Este protocolo descreve os métodos para examinar detalhes morfológicos específicos dos três tipos de representante dos organismos e seria amplamente aplicável para examinar características de muitos organismos e tipos de tecido.

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Aqui, um protocolo para a implementação de microscopia de expansão em embriões iniciais de Drosophila para obtenção de imagens de super-resolução usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser é apresentado.

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

Aprenda a preparar células S2 de Drosophila para microscopia de luz usando lectina ConA e imunomarcação. Este protocolo facilita a visualização de estruturas celulares e análise funcional de genes.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

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