Name: Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a preparar células S2 de Drosophila para microscopia de luz usando lectina ConA e imunomarcação. Este protocolo facilita a visualização de estruturas celulares e análise funcional de genes.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional do Câncer P30 CA23074, a American Cancer Society Research Grant Institucional 74-001-31, ea Univ. do Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para o campo de biologia celular, um sistema ideal seria barato de manter, fácil de manipular, e passíveis de uma variedade de técnicas. Células Drosophila S2 satisfazer essas exigências, e assim eles tornaram-se rapidamente o sistema de escolha para um crescente número de celular laboratórios de biologia. Nós apresentamos um breve resumo dos métodos para preparar células S2 para microscopia. Uma virtude notável de células S2 é o fato de que eles crescem bem em atmosfera normal e te...

<table><tbody><tr><td>Células S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>DGRC</td><td>número de estoque 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>meio livre de soro</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>meio livre de soro</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>meio livre de soro</td></tr><tr><td>Meio Schneider&amp;rsquo;s S2</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Adicione 10% (final) de FBS inativado pelo calor para obter o meio completo.</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inativado pelo calor</td></tr><tr><td>Solução antibiótica 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contém penicilina (10000 U/mL),&lt;br/&gt;estreptomicina (10000 &amp;#x03BC;g/mL) e&lt;br/&gt;anfotericina B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>solução a 32%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anidro, grau ACS</td></tr><tr><td>Peneiras moleculares</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>tipo 3A</td></tr></tbody></table>

preparação de drosophila células s2 para microscopia de luz

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

O sistema experimental ideal seria barato e fácil de manter, passíveis de uma variedade de técnicas, e seria apoiado por uma extensa literatura e banco de dados seqüência do genoma. Células cultivadas Drosophila S2, o produto de embriões disassociated 20-24 horas de idade 1, possui todas essas propriedades. Conseqüentemente, as células S2 são extremamente bem adaptados para a análise de processos celulares, incluindo a descoberta de genes que codificam os componentes moleculares do processo ou mecanismo de interesse. As características de células S2 que são mais responsáveis ​​pela sua utilidade é a facilidade com que eles sejam mantidos, a sua sensibilidade apurada para double-stranded (ds) RNA de interferência mediada (RNAi), e sua docilidade para microscopia de fluorescência como ao vivo ou fixo células. Células S2 podem ser cultivadas em uma variedade de meios, incluindo uma série de baixo custo, disponíveis comercialmente, totalmente definido, sem soro media 2. Além disso, eles crescem de forma otimizada e rapidamente a 21-24 ° C e podem ser cultivadas em uma variedade de recipientes. Ao contrário das células de mamíferos, as células S2 não necessitam de um ambiente regulado, mas sim fazer o bem com o ar normal e pode até mesmo ser mantido em frascos lacrados. Complementando a facilidade de RNAi em células S2 é a capacidade de analisar rapidamente fenótipos experimentalmente induzida por fase ou microscopia de fluorescência de células fixas ou ao vivo. Células S2 crescer em cultura como uma monocamada única, mas não exibem inibição por contato. Em vez disso, as células tendem a crescer em colônias nas culturas densas. Em baixa densidade, culturas S2 cultivadas em vidro ou plástico da cultura de tecidos tratados são redondos e fracamente ligados. No entanto, a citologia de células S2 pode ser muito melhorada, induzindo-os a se achatar extensivamente através da cultura brevemente as sobre uma superfície revestida com a lectina, concanavalina A (ConA) 3. Células S2 também pode ser estavelmente transfectadas com marcadores fluorescentes marcadas para estruturas rótulo ou organelas de interesse em células vivas ou fixos. Portanto, o cenário habitual para a análise microscópica de células é esta: primeiro, as células S2 (que pode possuir para expressar transgenes marcadores marcados) são tratados por RNAi para eliminar uma proteína-alvo (s). RNAi tempo de tratamento pode ser ajustado para permitir que as diferenças em proteína turn-over cinética e para minimizar o trauma celular / morte, se a proteína-alvo é importante para a viabilidade. Em seguida, as células tratadas são transferidos para um prato contendo uma lamela pré-revestida com ConA para induzir as células a se espalhar e firmemente aderem ao vidro. Finalmente, as células são gravadas com a escolha do pesquisador de modos de microscopia. Células S2 são particularmente bons para estudos que necessitem de visualização alargado de células vivas uma vez que estas células se manter saudável à temperatura ambiente e atmosfera normal.

Drosophila Schneider (S2), as células são um sistema cada vez mais popular para a descoberta e análise funcional de genes. Nosso objetivo é descrever algumas das técnicas microscópicas que formam células S2 tal sistema cada vez mais importante experimental.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

O sistema experimental ideal seria barato e fácil de manter, adaptável a uma variedade de técnicas e seria respaldado por uma literatura extensa...

O objetivo geral deste procedimento é descrever o preparo de células S de Drosophila para microscopia de luz. Isso é realizado primeiramente preparando-se placas de cultura com fundo de vidro. O segundo passo do procedimento consiste em revestir o fundo de vidro com a lectina conval.A para promover a adesão e achatamento das células S dois. O terceiro passo do procedimento é adicionar meio de cultura e células S dois à placa de cultura. O passo final do procedimento é fixar e imunomarcar as células S dois na placa de cultura.No final, podem ser obtidos resultados que mostram a localização de proteínas de interesse marcadas com fluoro quatro ou por imunomarcação por meio de microscopia de fluorescência de células S dois vivas ou fixadas, respectivamente. Olá, sou Joey Club do laboratório de Greg Rogers, do Departamento de Biologia Celular e Anatomia da Universidade do Arizona. Sou John Nye, também do Laboratório Rogers.E eu sou Dan Buster, também. Estou no laboratório de Greg Rogers. Hoje vamos mostrar um procedimento para preparar células S2 de Drosophila para microscopia de luz.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a regulação da duplicação centriolar em Drosophila, analisando alterações no número e na estrutura dos centríolos após a eliminação ou superexpressão de proteínas reguladoras importantes. Vamos começar. Utilizamos placas de Petri padrão de 35 milímetros para fabricar nossas placas com fundo de vidro.Esses pratos com fundo de vidro mantêm as células em uma condição muito semelhante à sua condição normal de cultivo, além de permitir que células vivas sejam examinadas através de vidro de qualidade microscópica. Para a montagem dos pratos com fundo de vidro, utiliza-se como superfície de perfuração uma superfície coberta com fita de uma caixa de isopor com paredes grossas. Coloque a metade inferior de um prato de Petri de 35 milímetros sobre a superfície de perfuração, com o lado inferior do prato encostado na caixa de isopor, segurando firmemente as laterais do prato, e use uma furadeira manual com uma broca tipo espátula de três quartos de polegada para fazer um furo através do prato.Após perfurar todos os seus recipientes, utilize uma broca cônica com grão grosso e diâmetro aproximadamente igual ao da broca tipo pás para alisar a borda externa dos orifícios. Coloque a furadeira de lado, com a broca projetando-se sobre a borda da bancada. Segure a furadeira no lugar colocando algo pesado, porém maleável, sobre ela, como uma sacola de plástico resistente contendo 10 quilogramas de areia.Use o botão de trava para manter a furadeira funcionando continuamente. Alise a borda do seu recipiente segurando-o e movendo-o contra a broca de moagem para suavizar a borda irregular do novo orifício. Depois que as bordas externas dos orifícios tiverem sido alisadas, coloque as bases dos recipientes em um béquer grande e enxágue várias vezes com água destilada.Isso removerá as pequenas partes soltas de plástico ou isopor, que flutuarão posteriormente. Deixe os fundos das placas secando. Quando as placas estiverem secas, prepare a cola Sard 180 4.Misture a resina e o agente de cura em uma proporção de 10 para 1 em peso e agite bem. Aplique um pequeno círculo de cola ao redor do furo na superfície externa de cada placa. Em seguida, posicione um lamínula sobre o furo, em contato com a cola.O disco de vidro deve ter pelo menos cerca de um milímetro a mais que o diâmetro do orifício existente na placa de Petri e ser menor que o diâmetro da placa. O disco de vidro deve assentar-se suave e uniformemente contra a placa. Agora, coloque as placas de lado.Lado inferior, até secar. Isso pode levar um dia ou mais à temperatura ambiente, mas é possível aumentar a taxa de cura colocando as placas em um incubador aquecido. Uma vez que as placas estejam secas, elas podem ser revestidas com lectina conent A ou con A. Utilizamos con A porque duas células que se aderem a lamínulas revestidas com con A se achatam extensivamente e tornam-se excelentes espécimes para microscopia.Para revestir um recipiente, em um recipiente com fundo de vidro, espalhe 10 microlitros da solução de conne sobre a face superior do vidro. Após a secagem, esterilize o recipiente e sua tampa com luz UV. Em uma cabine de cultura de tecidos, posicione as peças de modo que suas superfícies internas fiquem diretamente voltadas para a lâmpada UV e ligue a luz esterilizante por pelo menos 45 minutos.Duas células S podem ser cultivadas em diversos meios. Para nossos propósitos, utilizamos o meio VITROGEN SF 902. Para preparar células S tratadas com RNAi para microscopia, ressuspenda suavemente as células e transfira-as para uma placa com fundo de vidro revestido com conne contendo dois mililitros de meio. Células saudáveis que entram em contato com a lamínula revestida com conne aderirão firmemente a ela e começarão a se espalhar.Esse processo deve ficar aparente em cerca de 15 minutos e deve estar completo entre 45 minutos e uma hora. Como as células S duas são facilmente mantidas sob condições normais de temperatura e atmosfera laboratorial, nenhuma condição especial ou equipamento é necessário quando as células estão no microscópio para prevenir desidratação; mantenha meio suficiente no recipiente sobre o microscópio. É possível realizar imagens em tempo real de células S duas por períodos prolongados.O tempo de duração desses experimentos é limitado apenas pelos problemas habituais de fotobranqueamento e fototoxicidade. As duas células podem ser fixadas em um recipiente com fundo de vidro ou em uma lamínula comum. No entanto, neste vídeo, demonstraremos a fixação e a imunomarcação em um recipiente com fundo de vidro.O metanol e o formaldeído são dois fixadores comuns para células S. Para fixação celular com metanol, primeiro resfrie cerca de 300 mililitros de metanol anidro em um béquer de vidro de um litro com tampa, dentro de um congelador à prova de explosões a menos 20 graus Celsius. Quando o metanol estiver frio, retire-o do congelador. Remova rapidamente o meio do recipiente de fundo de vidro e, em seguida, mergulhe rapidamente o recipiente no metanol.Retorne rapidamente o béquer contendo a placa ao congelador e fixe as células por 10 a 15 minutos. Após 10 a 15 minutos, remova a placa do béquer, despeje qualquer metanol remanescente e reidrate as células. Adicionando PBST, as células estão agora prontas para procedimentos padrão de coloração, como será demonstrado posteriormente para fixação celular.Com formaldeído, utilizamos formaldeído a 10% e tampão. Essa concentração relativamente alta de formaldeído é usada porque as células S2 não possuem filamentos intermediários citoplasmáticos, que de outra forma ajudariam a manter a morfologia e a organização celular durante o processo de fixação. Fixe as células em formaldeído a 10% por 10 a 15 minutos.Quando a fixação estiver completa, despeje o formaldeído em um béquer de resíduo e lave as células fixadas com três lavagens rápidas de PBST. Inicie o procedimento de imunomarcação adicionando um mililitro de solução bloqueadora às células fixadas durante 15 minutos. Rotineiramente, utilizamos soro normal de cabra a 5% em PBST.Descarte a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário diretamente sobre as células. Recoloque a tampa da placa de Petri para evitar a evaporação da solução de anticorpo e deixe o anticorpo incubar com as células por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, remova a solução de anticorpo primário.Utilize uma pipeta de transferência para adicionar dois mililitros de PBST à placa e aguarde cinco minutos antes de substituir o PBST. Em seguida, lave três vezes com PBST. Após a lavagem final, adicione 100 microlitros de anticorpo secundário diretamente sobre as células.Coloque a tampa do Petri de volta sobre a placa e deixe o anticorpo incubar com as células por 30 minutos, à temperatura ambiente. Quando os 30 minutos terminarem, remova o anticorpo secundário e realize três lavagens de cinco minutos cada com PBST.Por fim, adicione algumas gotas de meio de montagem diretamente sobre as células. Substitua a tampa da placa de Petri e, se necessário, armazene o recipiente a quatro graus Celsius no escuro. São mostradas aqui imagens representativas em contraste de fase de células S2 após semeadura em uma placa com fundo de vidro revestido, onde os números indicam os minutos após a semeadura.O achatamento espontâneo é evidente após 15 minutos e está essencialmente completo após 60 minutos. Observe que as células tornam-se escuras em contraste de fase à medida que se achatam sobre a lamínula revestida. Nesta imagem ampliada de células aderidas, as bordas estendidas e achatadas, indicadas pela seta, são claramente visíveis.Duas células S podem ser transfectadas para expressar proteínas marcadas com fluorescência que identificam estruturas de interesse em células fixadas ou vivas. Neste exemplo, células S foram transfectadas temporariamente com um construto de fusão consistindo em nucleofoína, um marcador para o núcleo, fundido ao fluoróforo EGFP. Essas células foram semeadas em um prato com fundo de vidro revestido com cona e, em seguida, visualizadas com contraste de fase DIC e fluorescência por epifluorescência.Células S2 tratadas com RNAi também podem ser fixadas e analisadas por imunofluorescência. Essas imagens mostram células S2 fixadas imunomarcadas para o marcador central PLP, mostrado em verde, e microtúbulos, mostrados em vermelho, além de coloração com DAPI para cromossomos, mostrada em azul. Antes da fixação e imunomarcação, as células foram submetidas a um tratamento de quatro dias com RNAi controle ou RNAi para silenciar a proteína NCDA KINESIN, que promove o foco dos polos do fuso.O tratamento com RNAi de NCD resultou em células com polos do fuso afastados e fusos desorganizados. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter muito cuidado ao perfurar furos nas placas de cultura. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

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