Name: Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprenda métodos de entrega sistêmica e local de drogas para o sistema nervoso central em modelos de roedores, incluindo injeção intravenosa, intraperitoneal, gavagem oral e entrega por convecção.

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NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1-01.426 Gostaríamos de agradecer a Raquel Santos para assistência técnica.

1. Sistêmica Métodos de entrega Apesar de administração sistêmica de drogas não é a abordagem mais eficiente para atingir concentrações elevadas de drogas no SNC, as entregas sistêmica são convenientes e bem aceito pelos pacientes. Aqui, iremos demonstrar os procedimentos adequados para três abordagens de rotina usado administração sistêmica: a injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, e gavagem oral. A. injeção intravenosa (injeção veia da cauda) <ol><li> Antes de iniciar o procedimento, o peso corporal de cada rato devem ser registrados. Como em todos os estudos pré-clínicos, o peso corporal deve ser monitorada regularmente (duas vezes por semana ou mais) para avaliar a toxicidade potencial da droga. Não mais do que 1% do peso corporal do rato no volume deve ser injetado em uma única vez. Por exemplo, não mais que 0,2 mL de líquido deve ser injetado em um rato 20g. Todos os fluidos injetados por via intravenosa devem ser esterilizados por um método apropriado. </li><li> O mouse deve ser aquecido por 5-10 minutos usando uma almofada de aquecimento ou de uma lâmpada de calor para dilatar a veia da cauda. Se estiver usando uma lâmpada de calor, monitorar o mouse em todos os momentos para evitar hipertermia. </li><li> O mouse é transferido para um dispositivo de fixação, que restringe o mouse, permitindo o acesso à veia caudal (ver vídeo). Na cauda do rato, existem quatro vasos visíveis: os vasos nos lados dorsal e lateral são veias, eo navio no lado ventral é uma artéria. Para acessar a veia da cauda, ​​a cauda do rato é realizada no ponto mais distal, e rotação de 90 graus, para que a veia é voltado para cima. O local da injeção é limpo com um algodão embebido em álcool e uma seringa de insulina 28g é inserido, o lado chanfrado para cima, para dentro da veia (ver vídeo). Se a agulha está correctamente colocada na veia, ela deve mover-se livremente e sem pressão. Lentamente injetar a droga, mesmo com a pressão mais de 5-10 segundos. Se uma bolha aparece na cauda, ​​pare de injetar, pois isso indica que a agulha não está mais na veia. </li><li> Após a injeção, aplique uma leve pressão no local da injeção até que o sangramento pare. Isso normalmente leva 30-60 segundos. Monitorar o mouse por 5-10 minutos após a injeção para assegurar que não há mais sangramento. </li></ol> B. injeção intraperitoneal <ol><li> Antes de iniciar a injeção, a droga deve ser carregado em uma seringa conectada a uma agulha 28g. Certifique-se que há espaço na seringa para desenhar o êmbolo antes da injeção (por exemplo, se injetar 200μL, certifique-se que a capacidade da seringa é 300 ul ou superior). </li><li> Remova o mouse da gaiola por sua cauda e colocá-lo em uma superfície texturizada, para que o mouse tem algo a aderência. Uma tampa de gaiola é geralmente suficiente. Permitir que o mouse para esticar seu corpo e em seguida, usando sua mão não-dominante, segure a pele na parte de trás do rato, tendo o cuidado de ânimo leve pitada de pele, tanto quanto possível entre o polegar eo dedo indicador e médio (ver vídeo). Vire o mouse de forma que o abdômen do mouse é virada para cima. Se o rato pode se mover livremente sua cabeça, solte a pegada e tentar novamente, de forma a evitar ser picado durante a injecção. </li><li> Com sua mão dominante, pegar a seringa e insira a agulha em um ângulo de 30 graus no quadrante inferior esquerdo do mouse (ver vídeo). Segurando o mouse ligeiramente invertida vai ajudar a mover os órgãos de distância do local da injeção. Para garantir que a agulha está no espaço intraperitoneal, puxe o êmbolo da seringa. Se qualquer líquido ou sangue aparece na seringa, a agulha não está no espaço intraperitoneal e deve ser removido. Se nenhum líquido é aspirado para dentro da seringa, em seguida, injetar o conteúdo da seringa com uma pressão ainda mais de 1-5 segundos e solte o mouse. </li><li> Monitorar o mouse por 5-10 minutos após a injeção para assegurar que o mouse volta a níveis de atividade normal. </li></ol> C. Oral Gavage <ol><li> Antes de iniciar a injeção, registro do peso do mouse. O volume máximo que pode ser entregue por sonda oral é 10 ml por quilo de peso corporal. Por exemplo, o volume máximo de um rato 20g seria 200μL. A tentativa de injetar grandes volumes pode resultar em refluxo, o que fará a entrega da droga incompleta. Se for necessário administrar volumes maiores que as apontadas acima, até três doses podem ser administradas mais de 24 horas. </li><li> Para evitar a perfuração do esôfago, é importante para medir o comprimento da agulha gavagem para cada rato. Segure uma ponta de bola de 18g-agulha curvo gavagem na última costela do mouse, e depois marcar o comprimento da ponta da cabeça do rato usando um marcador permanente (ver vídeo). Durante a gavagem, a marca será um ponto de parada ao inserir a agulha na boca do mouse. </li><li> Contenha o mouse usando o aperto de mão mesmo que para uma injeção intraperitoneal. Inserir a agulha gavagem na boca, sobre a língua, e advance a agulha através da faringe. Não insira a agulha após a marca de parar. A agulha deve prosseguir sem problemas, sem qualquer tipo de pressão (ver vídeo). Se você encontrar a pressão, parar e retirar a agulha para evitar a injeção de fluidos nos pulmões. </li><li> Com a agulha no lugar, o êmbolo mais 1-5 segundos e depois retire a agulha no mesmo ângulo que foi inserido. Monitorar o mouse por 5-10 minutos, prestando muita atenção a qualquer sinal de dificuldade para respirar que pode indicar que o fluido tenha entrado no pulmão. </li></ol> 2. Entrega Local Aguda Convecção-Enhanced Entrega A. Construção da sonda A cânula refluxo resistente CED para roedores ainda não é comercialmente disponível. Aqui vamos demonstrar um método para a construção de cânula que foi adaptado de um primeiro método descrito por Krauze et al (Krauze 2005). <ul><li> A cânula tem três partes (Figura 1): tubo de sílica 100um de diâmetro através do qual os fluxos infusato, uma agulha de metal rígido para o apoio estrutural e flexível tubo de Teflon para carregar o infusato. </li><li> Para obter a agulha de metal rígido, use uma chama para derreter o plástico em um cateter IV Surflo (24g estilete) e usando uma pinça retire a agulha de metal. O resto do cateter pode ser descartada. Corte um pedaço de tubo de sílica (OD 0,163 milímetros), ligeiramente mais longo que a agulha de metal, utilizando uma lâmina de barbear única de ponta. Tubo de papel da sílica em uma pequena gota de cianoacrilato cola de ação rápida com base (por exemplo, Krazy Glue), tomando cuidado para não deixar nenhuma cola nas extremidades do tubo. Insira o tubo de sílica na agulha de metal e deixe secar por 5 minutos. </li><li> Depois de seco, o tubo de sílica deve ser solidamente fixado sobre a agulha. As extremidades da sílica devem ser aparadas para que se projeta 2mm de sílica tubulação da extremidade pontiaguda da agulha e 3 milímetros de tubos de sílica se projeta a partir da extremidade plana (ver vídeo). </li><li> Cortar uma seção de tubo de Teflon 20 cm de comprimento. Rolo da agulha de metal em uma pequena gota de cola, novamente tomando cuidado para não se cola nas extremidades do tubo de sílica como este vai obstruir a cânula. Inserir a agulha no tubo de Teflon a uma profundidade de 1cm. Deixe secar por 1 minuto. Usando uma pistola de cola, aplique uma gota de cola quente para a articulação entre a agulha de metal eo tubo de Teflon (ver vídeo). Assegurar que todo o conjunto é coberto por todos os lados e deixe secar por pelo menos 1 hora. Cânulas podem ser feitas até uma semana de antecedência e armazenado em temperatura ambiente. </li></ul> B. Procedimento de Infusão <ul><li> Para preparar a área cirúrgica, as superfícies devem ser pulverizadas com um desinfectante, como uma solução de clorexidina a 2%. Luvas cirúrgicas estéreis, devem ser usados ​​durante o procedimento. As superfícies são então cobertas com cortinas absorventes. As fontes a seguir deve ser colocado na área cirúrgica: <ul><li> Almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato </li><li> Duas pequenas placas de Petri, um contendo peróxido de hidrogênio 3% e uma contendo clorexidina a 2% </li><li> Swabs estéreis gaze e algodão </li><li> Bisturis descartáveis ​​estéreis (Número 21) </li><li> Estéreis as agulhas 22g </li><li> Rato estereotáxica quadro </li><li> Bomba de seringa taxa controlada </li><li> Autoclavado pele do rato grampeador, grampos, e removedor de grampos </li></ul></li><li> Para configurar a cânula CED, anexar uma seringa 1 ml para o tubo de Teflon usando um conjunto de adaptadores de seringa de plástico. A cânula deve ser afixada no quadro de estereotáxica para que seja perpendicular à superfície cirúrgica (ver vídeo). Para desinfetar a cânula, encha a seringa com 1 ml de etanol 70% e pressionar o êmbolo para executar o etanol através da cânula. Repita esse processo com solução salina estéril, e verificar se há algum vazamento em torno das articulações cânula. Para desinfetar a parte externa da cânula, limpe com um álcool 70% limpe. </li><li> Preencher a cânula com solução salina estéril e, em seguida, puxe seringa de modo que uma pequena bolha de ar é atraído para a cânula. Esta bolha de ar vai separar o infusato da solução salina na cânula. Então, protelar o seu infusato (ver vídeo). Conectar a seringa à bomba de seringa e bombear o prime rodando por breves instantes, a cânula. </li><li> Sedar o rato usando um anestésico injetado e preparar a pele limpando várias vezes (por 5-10 segundos) com um pedaço de gaze estéril embebida em solução de clorexidina a 2%. Pomada oftálmica deve ser aplicado o mouse para manter a umidade adequada durante o procedimento. Utilizando um escalpelo esterilizado, criar uma incisão sagital ao longo do centro do crânio, aproximadamente 1,5 cm de comprimento (ver vídeo). A superfície do crânio é então limpo com um cotonete embebido em uma solução de 3% de peróxido de hidrogênio. Tome cuidado para evitar o peróxido de hidrogênio nos olhos do mouse. Linhas de sutura do crânio deve ser aparente neste ponto: se eles não estiverem visíveis, gentilmente limpe o crânio com um fresh cotonete embebido em solução a 3% de peróxido de hidrogênio. </li><li> Identificar o bregma (Figura 2) e em seguida medir dois milímetros para a direita e 1mm posterior desta estrutura para localizar o local de infusão. Usando a agulha estéril 22g, gentilmente criar um buraco no crânio, neste ponto, torcendo a agulha contra o crânio (ver vídeo). Evite forçar a agulha para baixo contra o crânio. </li><li> Neste ponto, o mouse deve ser colocado na armação estereotáxica e começar a receber anestesia inalatória (ver vídeo). Administrar o anestésico em um nível baixo (1%), e acompanhar atentamente o mouse para mudanças na taxa de respiração, ajustando o anestésico em conformidade. </li><li> Posição da cânula sobre o furo do crânio e abaixe 3 milímetros abaixo da superfície do crânio. Começar a infusão, utilizando as seguintes taxas e durações: <table border="0"><tbody><tr><td> 0,1 mL / min por 5 minutos </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="Total Volume 10 ul" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Volume total de 10 ul"></td></tr><tr><td> 0,2 mL / min por 5 minutos </td></tr><tr><td> 0,5 mL / min por 5 minutos </td></tr><tr><td> 0,8 mL / min para 7,5 minutos </td></tr><tr><td> OFF por 1 minuto </td></tr></tbody></table></li><li> No final da infusão, lentamente, remova a cânula e swab crânio com peróxido de hidrogênio 3%. Aplicar cera de osso estéril para o buraco (ver vídeo). Utilizando uma pinça, tirar a pele junto sobre o crânio e grampo para fechar. Buprenorfina deve ser administrada no pós-operatório alívio da dor. </li><li> Monitorar o mouse no pós-operatório até que ele recobra a consciência e mobilidade. Devido à morosidade do processo, pode demorar até uma hora para o mouse para recuperar a plena atividade. Durante este tempo, lugar a gaiola do mouse sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia, e não a casa do rato recuperando com outros ratos ativo. </li><li> Grampos de pele devem ser removidos uma semana após a cirurgia. </li></ul> C. In Vivo de imagem Infusato fluorescente-rotulados podem ser visualizados após a administração CED, e pode ser monitorado para mudanças na intensidade do sinal bem como a localização do sinal. Normalmente, é melhor esperar 2-3 horas após a infusão de imagem, de modo a permitir o mouse para se recuperar da infusão. <ul><li> Para anestesia durante o exame, use um baixo nível de um anestésico inalatório. Posicione o rato, o lado dorsal para cima, em uma estação de imagens (por exemplo, IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Usando uma configuração apropriada de filtro para o fluor que está sendo fotografada, adquirir uma imagem. Para CED, uma infusão bem-sucedido deve mostrar a maioria do material no cérebro perto do local de perfusão (Figura 3). </li></ul> 3. Resultados representante A falta de reação adversa a administração da terapia é um importante indicador da injeção de sucesso. Por exemplo, após a injeção das veias da cauda não deve haver mudança na aparência (por exemplo, tamanho, cor) da cauda. Uma bolha ou blister a seguir à injecção veia da cauda indicaria subcutânea, em vez de entrega, por via intravenosa de terapia. Para injeções intraperitoneal, uma colisão na pele ou descoloração do abdómen pode indicar a injeção subcutânea ou danos a estruturas internas. Em gavagem oral, um mouse com dificuldade para respirar ou tossir pode indicar que o líquido era injetado para dentro dos pulmões, ao invés de para o estômago. Para CED, a função neurológica é importante para avaliar a administração de sucesso da terapia. Um rato que está apresentando convulsões ou hemiparesia pode ter recebido uma infusão impróprio. Se um infusato fluorescente é utilizado, in vivo de imagens pode ser aplicado para avaliar a administração bem sucedida (Figura 3). Se o infusato não está localizada no local da injeção, a perfusão não foi bem sucedida. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Cânula CED e Cirúrgica Set-up. Os elementos básicos da entrega de convecção-enhanced cirúrgica set-up são mostrados. Uma bomba microinfusion (A) é acoplada a uma cânula de infusão (B, em tamanho ampliado no topo). Uma moldura estereotáxica (C) é usado para posicionar a sonda. Esta imagem não inclui equipamento de aquecimento e anestésico usado também durante o procedimento. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Linhas de rato Suture Caveira. O local de infusão CED (estrela vermelha) podem ser localizados através da identificação da intersecção das suturas sagital e coronal (o bregma) e medindo 2 milímetros lateral e um milímetros posterior do bregma. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Resultados Representante do CED sucesso. Liposomes marcado com um corante vermelho-distante fluorescentes foram infundidas no cérebro de camundongos pelo CED e fotografado in vivo e ex vivo. A infusão de sucesso mostra um sinal fluorescente localizada no local da perfusão tanto in vivo (A) e ex vivo (B). O sinal deve ser localizada no hemisfério infundida sem fuga para o hemisfério contralateral. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Imagem Representante do CED sucesso no tronco cerebral de ratos. Lipossomas fluorescente-marcadas foram infundidas no tronco cerebral de ratos. Em ratos, tanto quanto 20μL pode ser infundido. O aumento da espessura do crânio de ratos e profundidade de injeção in vivo impedido de imagem, mas a localização de infusão correta pode ser verificada por meio de imagens ex vivo do cérebro dissecado.

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</ol>

Todos os procedimentos aqui demonstrados foram aprovadas pelo Animal Care UCSF Institucional e Comitê de uso.

Avaliação pré-clínica da eficácia de qualquer agente terapêutico deve levar em conta as propriedades farmacológicas do agente e do tecido alvo de interesse. Enquanto os métodos de administração sistêmica são em geral mais fácil e melhor tolerada pelos pacientes, a seletividade da barreira hemato-encefálica, muitas vezes necessita de local de entrega da terapia para o tratamento da doença do SNC. Aqui, nós demonstramos um método de entrega direta para o cérebro: CED. Outras formas de entrega local para o cérebro incluem a administração direta com o líquido cefalorraquidiano, a injeção intratumoral bolus, e injeção ventricular. Para estes métodos, difusibilidade de terapêutica é extremamente importante, com difusão de pobres limitar a região de cobertura a alguns milímetros do local da injeção (Jain 1989, Bobo, 1994). Em contraste, CED usa pressão positiva para aumentar a área de distribuição de drogas (Bobo 1994), enquanto ainda permitindo que o alvo para terapêutica específica estruturas neuroanatômicas. Em nosso laboratório, conseguimos CED realizada no tronco cerebral, bem como para o putâmen caudado em roedores (Figura 4). A habilidade de conduzir CED em modelos de roedores tem se tornado cada vez mais importante na associação com crescente interesse em maximizar a eficácia terapêutica no tratamento de vários tipos de doença do SNC. CED pode ser usada para fornecer uma variedade de agentes, incluindo proteínas purificadas, medicamentos de pequenas moléculas e vírus (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). A gama de doenças que podem ser tratados com CED inclui cânceres do SNC (Yamashita 2007), bem como doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson (Gill, 2003). Como a pesquisa CED continua a se expandir, a necessidade de em imagens in vivo da terapia administrada CED é igualmente crescente. Enquanto a imagem fluorescente demonstrado aqui, provavelmente não será visível através do crânio humano, outros métodos que empregam co-infusão de agentes de contraste MRI (Dickinson 2008) estão atraindo o interesse para avaliar a aplicabilidade para o monitoramento infusatos em pacientes com doença do SNC.

<table><tbody><tr><td>Clorhexidina 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td>Conhecida como Nolvasan&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Agulha 20g</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 28g (com seringa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-004-270</td><td>Conhecida como Seringa de Insulina</td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio 3%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td>Armazenar longe da luz</td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td>Autoclavar antes do uso</td></tr><tr><td>Adesivo à Base de Cianoacrilato</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9592632</td><td>Conhecido como Krazy Glue&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Escalpelos Descartáveis</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>Nº 21</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td>Autoclavar antes do uso</td></tr><tr><td>Manta Térmica</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Cateter Intravenoso</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-20</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Infusão</td><td>BASi</td><td>MD-1000, MD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Software Living Image</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Consultar Orçamento</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Oftálmica</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>Conhecida como Akwa Tears&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Adaptadores Plásticos para Seringas</td><td>Upchurch Scientific</td><td>P-604, P-200NX, P-215X, P-630</td><td>Encaixa em Seringas Luer Lock</td></tr><tr><td>Tubo de Sílica</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000020</td><td></td></tr><tr><td>Grampeador de Pele, Grampos e Removedor</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Quadro Estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Teflon</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Consultar Orçamento</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Testes pré-clínicos completa do sistema nervoso central (SNC) terapêutica inclui uma reflexão sobre as vias de administração e biodistribuição agente em avaliação da eficácia terapêutica. Entre as duas principais classificações de administração, local versus sistêmica, abordagem sistêmica de entrega são muitas vezes preferido devido à facilidade de administração. No entanto, a entrega sistêmica pode resultar em concentração do fármaco suboptimal sendo alcançados no SNC, e levar a conclusões errôneas em relação à eficácia do agente. Métodos de entrega local de drogas são mais invasivos, mas pode ser necessário para atingir níveis terapêuticos CNS drogas. Aqui, demonstramos a técnica adequada para três rotas de entrega de medicamentos sistêmicos: injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, e gavagem oral. Além disso, vamos mostrar um método para entrega local para o cérebro: convecção avançada de entrega (CED). O uso de compostos fluorescentes marcado é incluído para in vivo de imagens e verificação de administração do medicamento adequado. Os métodos são apresentados usando modelos murinos, mas pode facilmente ser adaptado para uso em ratos.

Testes pré-clínicos completa de drogas que atuam no sistema nervoso central, muitas vezes envolve a avaliação e comparação de biodistribuição da droga em associação com rotas específicas de administração. Aqui, três métodos comumente utilizados de entrega sistêmica (intravenosa, intraperitoneal e oral), bem como um método para entrega local (convecção avançada entrega) são demonstrados em camundongos.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Testes pré-clínicos rigorosos de agentes terapêuticos para o sistema nervoso central (SNC) incluem a consideração das vias de administração e da biodistribuição do agente...

Neste artigo em vídeo, são demonstrados quatro métodos de administração de fármacos no sistema nervoso central. Os três primeiros métodos são injeção intravenosa, injeção intraperitoneal e gavagem oral. Os três métodos resultam na administração sistêmica do fármaco.O método final consiste em uma infusão local de fármaco no cérebro do camundongo. Para este método, utiliza-se a imagem óptica in vivo para verificar a infusão adequada. As três técnicas de administração sistêmica são procedimentos padrão amplamente utilizados em ambientes pré-clínicos.A técnica de administração local é um pouco mais desafiadora, mas permite a administração direta do agente ao cérebro, contornando a barreira hematoencefálica. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais em oncologia nova, como a eficácia e a distribuição de terapêuticos inovadores, embora esses métodos possam fornecer informações sobre o tratamento inovador de tumores cerebrais.Esses métodos também podem ser aplicados a outras doenças do sistema nervoso central, como distúrbios neurodegenerativos e psiquiátricos. Utilizando uma lâmpada de aquecimento para dilatar a veia da cauda do camundongo aquecido por cinco a 10 minutos, monitore cuidadosamente o camundongo em todos os momentos para evitar hipotermia durante o aquecimento. Carregue o fármaco em uma seringa de insulina de calibre 28.Não se deve injetar mais de 1% do peso corporal do camundongo de uma só vez. Após cinco a 10 minutos, transfira o camundongo para um dispositivo de contenção na cauda do camundongo, onde há quatro vasos visíveis.Os vasos dorsais e laterais são veias. O vaso ventral é uma artéria. Para acessar a veia lateral da cauda, segure a cauda do camundongo no ponto mais distal e gire-a 90 graus de modo que a veia fique voltada para cima. Limpe os locais de injeção com um cotonete umedecido em álcool.Em seguida, insira a seringa preparada com a bisnaga voltada para cima na veia. Se a agulha estiver corretamente posicionada na veia, deverá mover-se livremente e sem pressão. Injete lentamente o medicamento com pressão constante durante cinco a 10 segundos.Se a cauda ficar inchada, interrompa a injeção, pois isso indica que a agulha já não está na veia. Após a injeção, aplique pressão suave no local da injeção até que o sangramento pare. Isso normalmente leva de 30 a 60 segundos.Monitore o camundongo por cinco a 10 minutos para garantir que não haja sangramento adicional. Prepare-se para este procedimento carregando uma seringa com uma agulha de 28 graus com a droga. Retire o camundongo da gaiola pela cauda e coloque-o sobre uma superfície texturizada, como a tampa de uma gaiola, para que o camundongo tenha algo em que se segurar.Permita que o camundongo estique o corpo. Em seguida, segure a pele nas costas do camundongo, tomando cuidado para pinçar suavemente o máximo de pele possível entre o polegar e os dedos indicador e médio. Vire o camundongo de modo que o abdômen fique voltado para cima.Se o camundongo puder mover livremente a cabeça, solte a pressão e tente novamente. Para evitar mordidas durante a injeção, segure o camundongo levemente invertido para ajudar a afastar os órgãos do local da injeção. Insira a agulha da seringa preparada num ângulo de 30 graus no quadrante inferior esquerdo do camundongo para garantir que a agulha esteja no espaço intraperitoneal.Puxe para trás o êmbolo da seringa. Se nenhum fluido for aspirado para dentro da seringa, então injete o conteúdo da seringa com pressão constante durante um a cinco segundos. Solte o camundongo.Monitore o camundongo por cinco a 10 minutos após a injeção para garantir que ele retorne aos níveis normais de atividade. Inicie a gavagem oral determinando até que ponto a agulha pode ser inserida na boca do camundongo. Segure uma agulha curva para gavagem com ponta de bola de 18 G na última costela.Marque o comprimento usando uma caneta permanente. Pese o camundongo para determinar o volume de injeção. O volume máximo que pode ser administrado por gavagem oral é de 10 mililitros por quilograma de peso corporal.Em seguida, carregue a cânula. Depois, imobilize o camundongo utilizando o mesmo aperto mostrado para a injeção intraperitoneal. Insira a cânula na boca, por cima da língua, e avance a cânula através da faringe para evitar perfurar o esôfago.Não insira a agulha além da marca de parada. A agulha deve avançar suavemente, sem qualquer pressão. Com a agulha no lugar, pressione lentamente o êmbolo.Remova a agulha no mesmo ângulo em que foi inserida. Não tente injetar volumes maiores do que o recomendado, pois isso pode resultar em refluxo e entrega incompleta do fármaco.Coloque o camundongo de volta na sua gaiola e monitore-o por cinco a 10 minutos. Observe atentamente qualquer sinal de dificuldade respiratória, o que pode indicar que o fluido entrou nos pulmões. Repita este procedimento conforme necessário.Pode-se administrar até três doses em um período de 24 horas, já que uma cânula de CED resistente a refluxo para roedores ainda não está disponível comercialmente. Construa uma cânula composta por três partes: um trecho de tubo de sílica com diâmetro de 100 mícrons, pelo qual o agente infundido flui.Uma agulha metálica rígida para suporte estrutural e tubo flexível de teflon para carregar o infusor.Eight. Para preparar a área cirúrgica, pulverize todas as superfícies com desinfetante de clorexidina a 2%. Em seguida, cubra as superfícies com campos absorventes.Os seguintes materiais devem ser colocados na área cirúrgica. Escolha mais placas de Petri, uma contendo peróxido de hidrogênio a 3% e outra contendo clorexidina estéril, além de hastes flexíveis com cotonete. Lâminas cirúrgicas descartáveis estéreis número 21, autoclave, grampeador cirúrgico para pele de camundongo, grampos e removedor de grampos.Aguilhas estéreis de calibre 20, um aquecedor para manter a temperatura corporal do camundongo, um estereotáxico para camundongo e uma bomba de seringa de taxa controlada. Para montar o cânula, conecte uma seringa de um mililitro ao tubo de teflon. Usando um conjunto de adaptadores plásticos para seringas, fixe o cânula ao estereotáxico de modo que fique perpendicular à superfície cirúrgica.Usando uma seringa de um mililitro, desinfete a cânula passando etanol 70% por ela. Repita este processo utilizando solução salina estéril. Em seguida, verifique a presença de vazamentos ao redor das articulações da cânula.Puxe o êmbolo da seringa para que uma pequena bolha de ar seja aspirada para dentro da cânula. Essa bolha de ar separará o infuse eight do soro fisiológico. Em seguida, carregue o infuse eight por trás.Priminga a bomba fazendo-a funcionar brevemente com a cânula. Substitua a pele de um camundongo anestesiado por gaze estéril mergulhada em clorexidina a 2%, aplique pomada oftálmica para manter a umidade adequada dos olhos durante o procedimento. Usando um bisturi estéril, faça uma incisão sagital ao longo do centro do crânio, com aproximadamente 1,5 centímetro de comprimento.Limpe a superfície do crânio usando um cotonete embebido em uma solução de peróxido de hidrogênio a 3%. Neste momento, as linhas das suturas do crânio devem estar aparentes. Caso contrário, passe suavemente um cotonete novo embebido em solução de peróxido de hidrogênio a 3% sobre o crânio.Identifique o bgma, depois meça dois milímetros para a direita e um milímetro posteriormente para localizar o local de infusão. Utilizando uma agulha estéril de calibre 20, crie suavemente um orifício no crânio neste ponto girando a agulha contra o crânio. Evite forçar a agulha para baixo contra o crânio.Neste momento, transfira o camundongo para o estereotáxico e comece a administrar o anestésico inalatório em um nível baixo. Monitore cuidadosamente o camundongo quanto a alterações na frequência respiratória, ajustando o anestésico conforme necessário.Portanto, esta próxima etapa é provavelmente o aspecto mais difícil de todo o método. Ao posicionar a cânula, certifique-se de centralizá-la sobre o orifício. Para isso, verifique o posicionamento da cânula a partir de todos os ângulos.Em seguida, posicione a cânula sobre o orifício no crânio e, então, abaixe três milímetros abaixo da superfície do crânio. Inicie a infusão ligando a bomba de seringa usando as taxas e durações mostradas aqui ao final da infusão. Remova lentamente a cânula e substitua o crânio por peróxido de hidrogênio a 3%.Aplicar cera óssea estéril no orifício utilizando pinça. Puxar a pele para unir as bordas e grampear para fechar. Administrar buprenorfina por via subcutânea para alívio da dor pós-operatória.Coloque o camundongo em uma gaiola sobre uma placa aquecida para evitar hipotermia. Não aloje o camundongo em recuperação com outros camundongos ativos. Monitore o camundongo no pós-operatório até que ele recupere a consciência e a mobilidade.Devido à duração do procedimento, pode levar até uma hora para o camundongo recuperar plenamente a atividade. Se for realizada a aquisição de imagens, é preferível aguardar de duas a três horas antes de realizar a imagem do agente infundido marcado com fluorescência. Oito. Após a administração por CED, posicione o camundongo anestesiado com a região dorsal voltada para cima em uma estação de imagem, utilizando uma configuração de filtro apropriada para a fluorescência que será observada.Adquira uma imagem para a CED. Uma infusão bem-sucedida deve mostrar a maior parte do material dentro do crânio, próximo ao local da infusão. A ausência de reação adversa à administração da terapia é um indicador importante de injeção bem-sucedida.Os seguintes são indicadores de injeções inadequadas para injeções na cauda: alteração na aparência do tamanho ou da cor da cauda, bolha ou blister na cauda, indicando administração subcutânea em vez de intravenosa. Para injeções intraperitoneais, uma saliência na pele ou descoloração do abdômen pode indicar injeção subcutânea ou dano a estruturas internas.Na gavagem oral, um camundongo com respiração ofegante ou tosse pode indicar que o fluido foi injetado nos pulmões em vez de no estômago. Na DCE, a função neurológica é importante para avaliar a administração bem-sucedida da terapia. Um camundongo que apresenta convulsões ou hemiparesia pode ter recebido infusão inadequada.Aqui, a imagem in vivo foi realizada em um camundongo com uma infusão de CED bem-sucedida mostrada à esquerda e uma infusão malsucedida mostrada à direita. Observe que, na infusão bem-sucedida, o sinal de imagem está localizado no cérebro. Já na infusão malsucedida, o sinal se espalhou ao longo do eixo neural.Como você viu, o aspecto mais desafiador deste procedimento envolve a seleção adequada da via de administração. Ao administrar medicamentos no sistema nervoso central, é importante considerar a propriedade farmacológica das drogas para selecionar a melhor via de administração. É isso aí.Espero que você tenha achado esta apresentação útil e desejo boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Milirrobôs magnéticos para administração de medicamentos específicos da região no sistema nervoso central de ratos

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Entrega baseada em microinjeção de um agente terapêutico em um cérebro de roedor acordado

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Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Descreve-se um método para alvejar fármacos para o sistema nervoso central por qualquer implante de um cateter ou realizar uma injecção de bolus no ventrículo lateral direito de ratos. Nós nos concentramos especificamente na entrega de oligonucleotídeos antisense. Esta técnica é facilmente adaptável a outros fármacos e a ratos.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

O presente protocolo descreve uma técnica de infusão de microcirurgia de camundongo, que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna

Aqui, nós apresentamos um protocolo usando um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada dos ratos para a administração intranasal de uma formulação do peptide-siRNA do cérebro-alvejando permitindo o silenciamento de gene eficaz no sistema nervoso central.

Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega de siRNA intranasal ao sistema nervoso central

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

Um método para fornecer células-tronco neurais, adaptáveis para soluções ou suspensões injetáveis, através da artéria carótida comum (mouse) ou artéria carótida externa (rato) após o derrame isquêmico ser relatado. As células injetadas são distribuídas amplamente por todo o parenchyma cerebral e podem ser detectadas até 30 d após o parto.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Aprenda métodos de entrega sistêmica e local de drogas para o sistema nervoso central em modelos de roedores, incluindo injeção intravenosa, intraperitoneal, gavagem oral e entrega por convecção.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

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