Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar as proteínas fluorescentes mOrange2 e Dronpa como marcadores ópticos duplos para rotular seletivamente quatro populações celulares individuais ou compartimentos celulares. Isso é conseguido primeiro iluminando as células com luz de excitação de baixa intensidade em 488 nanômetros para desativar toda a fluorescência verde da Dronpa. Como segundo passo, as células são expostas à luz de excitação de alta intensidade em 488 nanômetros, que fotoconverte a fluorescência de mOrange para vermelho.

Em seguida, as células são expostas à excitação de dois fótons em 800 nanômetros para ativar a fluorescência do dral. Mais uma vez, os resultados obtidos demonstram que é possível rotular células em quatro combinações distintas com base na marcação óptica dual com M Orange dois e ppa desenhado. A principal vantagem deste procedimento em relação a experimentos existentes, como a fracionamento subcelular, é que ele é realizado em células vivas.

Este procedimento pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia das células beta, como por que apenas uma pequena fração das vesículas de insulina é secretada. Embora este procedimento possa fornecer informações sobre a função das células beta, ele também pode ser aplicado a outros sistemas. Por exemplo, o rastreamento de células cancerígenas in vivo, uma amostra de gotículas de proteína fluorescente consiste em uma emulsão aquosa octal com uma proteína fluorescente localizada na fase aquosa.

Essa emulsão é colocada entre uma lâmina de microscópio e uma lamínula quadrada de 22 milímetros para aplicações em microscopia. No início deste procedimento, as lâminas e lamínulas de microscópio devem ser limpas e revestidas com um agente hidrofóbico. Limpe o material de vidro lavando-o por cinco minutos com acetona.

Após a lavagem, deixe o material de vidro secar ao ar. Em seguida, prepare uma solução de 2% de metil trimetóxi silano em acetona e recubra o material de vidro com a solução por dois minutos. Após o revestimento, remova o material de vidro da solução e deixe secar.

Em seguida, enxágue a vidraria com etanol 70% de um frasco pulverizador. Após a lavagem, deixe a vidraria secar ao ar novamente e remova qualquer líquido remanescente. Utilizando ar pressurizado, a vidraria revestida pode ser armazenada por pelo menos um mês.

Uma vez que o material de vidro tenha sido preparado, obtenha proteínas fluorescentes previamente purificadas como proteína com marcação his proveniente de e coli. Meça o espectro de absorvência da proteína purificada. Prepare uma diluição estoque com densidade óptica de aproximadamente 0,1 em solução de salina tamponada com tris com pH oito contendo 0,1% de albumina sérica bovina.

Além disso, prepare 10 mililitros de uma mistura um para um de um octal e solução salina tamponada com tris em um tubo cônico de 15 mililitros e agite vigorosamente. Após a mistura, deixe o conjunto até que a separação de fases esteja completa. A fase superior é o octal; para preparar a emulsão, pipete 45 microlitros de um octal e cinco microlitros de proteína fluorescente em um tubo epi ou orph.

Toque no tubo algumas vezes para iniciar a formação da emulsão, depois sonique o tubo por 30 segundos em um banho de ultrassom. Enquanto isso, prepare uma lâmina de microscópio revestida e uma lamínula após a sonicação. A emulsão deve ficar completamente opaca.

Pipete imediatamente quatro microlitros da emulsão do centro do tubo sobre uma lâmina de microscópio revestida e cubra com um lamínula revestido. A emulsão deve se espalhar uniformemente entre a lâmina e o lamínula. Em poucos minutos, a amostra deverá estar estável.

O procedimento a seguir é uma estratégia geral para montar um experimento de fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Este procedimento pode ser aplicado tanto a proteínas purificadas quanto a células vivas. Neste experimento, uma amostra em gota contendo a proteína purificada m orange two é utilizada como ponto de partida geral para o experimento de fotoconversão.

Configure o microscópio confocal de varredura a laser da seguinte maneira. Utilize uma objetiva de imersão a óleo com aumento de 40 x e abertura numérica de 1,3, e um tamanho de imagem de 512 por 512 pixels. Ajuste o tempo de permanência do pixel para seis microssegundos, o zoom para quatro e aumente o tamanho do pinhole para corresponder a uma resolução Z de três mícrons.

Configure dois canais de detecção para a fluorescência inicial e a convertida por fotoconversão, bem como um canal de fotoconversão. Observe as espécies laranjas utilizando luz de excitação de 561 nanômetros e colete a fluorescência entre 570 e 630 nanômetros. Detecte as espécies vermelhas convertidas por fotoconversão utilizando luz de excitação de 633 nanômetros e colete a fluorescência entre 640 e 700 nanômetros.

Para o canal de conversão fotográfica, selecione a linha do laser de 488 nanômetros e colete a fluorescência entre 490 e 540 nanômetros. Aquisição de imagem. O canal de conversão fotográfica não é estritamente necessário, mas pode ser útil. Para iniciar o experimento, utilize o canal do detector para imagens da fluorescência inicial com varredura contínua, ajustando a potência do laser e o ganho do detector para obter qualidade de imagem ideal.

Em seguida, ative o canal de fotoconversão e selecione a baixa potência do laser. Inicie a aquisição de uma série de imagens com lapso de tempo e aumente gradualmente o laser de fotoconversão até que um clareamento significativo da fluorescência inicial seja observado. Continue a varredura até que a fluorescência inicial esteja aproximadamente 75% clareada.

Em seguida, desative o canal de fotoconversão e ative o canal de detecção da fluorescência fotoconvertida. Inicie a aquisição de imagens com alto ganho do detector e baixa potência do laser. Aumente gradualmente a potência do laser até que a fluorescência fotoconvertida seja detectada.

Uma vez detectado, ajuste a potência do laser e a detecção ou ganho para obter qualidade ideal de imagem. Por fim, otimize a potência do laser utilizada para a fotoconversão, bem como sua duração. O aumento da potência do laser acelerará a taxa de fotoconversão.

No entanto, uma potência de laser excessiva causará fotobranqueamento da proteína. Uma vez determinadas a conversão fotoquímica ideal, a potência e a duração do laser, esses parâmetros podem ser utilizados para configurar um módulo padrão de fotobranqueamento ou um módulo de recuperação da fluorescência após fotobranqueamento. Em seguida, o canal de conversão fotoquímica não será mais necessário devido às propriedades espectrais de deslocamento para o vermelho da M laranja dois.

Pode ser usado em combinação com a proteína fluorescente verde comutável por luz desenhada PU para marcação óptica com dupla sonda. Para iniciar a marcação óptica com dupla sonda, cultive células HeLa em placas com fundo de vidro. Transfete as células com plasmídeos que codificam as proteínas fluorescentes 24 horas antes da aquisição de imagens, utilizando um transfeção padrão com LIPECTOMY 2000.

Coloque as células vivas em um microscópio confocal de varredura a laser e configure o microscópio para a conversão com duas fotos de M orange conforme descrito anteriormente. Em seguida, configure o microscópio para a comutação fotônica de DPA. O DPA é excitado com luz de 488 nanômetros e sua fluorescência pode ser visualizada utilizando o canal de conversão com duas fotos de M orange.

Certifique-se de minimizar a potência do laser utilizada para a imagem de MPA, pois uma potência excessiva causará a inativação de mpa. Adicione um canal para a fotoativação de MPA utilizando 800 nanômetros dois. Excitação por fótons subsequentemente determine a potência do laser necessária para a imagem da fotoativação e da foto-inativação da fluorescência OFA.

Um dos aspectos mais difíceis deste procedimento é inativar a RPA sem fotoconverter a M laranja. Como ambos os eventos ocorrem no mesmo comprimento de onda, é muito importante otimizar cuidadosamente a fotoconversão para evitar isso.

Potência e duração do laser Tenha cautela quanto à fotoconversão de M laranja dois. Uma inativação de PU ambos ocorrem após excitação com luz de 488 nanômetros para inativar PU sem fotoconversão significativa de M laranja dois. Utilize uma potência de laser mais baixa uma vez que os parâmetros para fotoconversão de M laranja dois e comutação fotoativa de DPA forem definidos.

Pode-se obter realce óptico com dupla sonda. Primeiro, inative a fluorescência de DPA em todo o campo de visão com excitação de baixa potência em 488 nanômetros. Em seguida, selecione uma região de interesse e converta a mOrange2 com excitação de alta potência em 488 nanômetros.

Por fim, selecione uma região de interesse e ative a fluorescência do DPA utilizando excitação de dois fótons a 800 nanômetros. As amostras de gotículas de proteína fluorescente são idealmente adequadas para configurar aplicações de fotoconversão em microscopia confocal. Quando a amostra de gotículas é preparada corretamente, as gotículas aparecem muito homogêneas.

No entanto, quando a amostra é preparada sem revestir a lâmina do microscópio com uma lamínula, as gotículas tendem a ser esmagadas contra uma das superfícies de vidro nas amostras preparadas. Na ausência de BSA 0,1%, a proteína fluorescente tende a se acumular na interface aquosa octa. A criação de um halo de fluorescência pela fotoconversão depende criticamente da potência do laser e da duração da exposição.

Excesso de potência do laser ou exposição prolongada causará fotobranqueamento e resultará na redução da fluorescência vermelha fotoconvertida. As propriedades espectrais distintas da M laranja dois e da PHO permitem o realce óptico dual com duas sondas antes da fotoconversão. Células que expressam M laranja dois, histona H dois B e DPA mito apresentam fluorescência laranja no núcleo e fluorescência verde nas mitocôndrias. Quando toda a fluorescência é desativada com excitação de baixa potência em 488 nanômetros, ocorre fotoconversão mínima da M laranja.

Duas M laranja dois podem então ser fotoconvertidas em vermelho com excitação de alta potência em 488 nanômetros. Uma vez que a M laranja dois tenha sido fotoconvertida, a fluorescência do sinal pode ser reativada usando excitação de dois fótons em 800 nanômetros. Com a marcação óptica de dupla sonda, as células podem ser rotuladas de quatro maneiras distintas.

Utilizando esta técnica, é possível rotular especificamente quatro populações celulares diferentes. Como você viu, um dos aspectos mais difíceis deste procedimento é inativar o MPA sem fotoconverter a mOrange. Uma vez dominado, experimentos adicionais podem ser realizados usando este sistema, por exemplo, o rastreamento de múltiplas populações em células beta pancreáticas.

É isso aí. Espero que você tenha achado esta apresentação útil e desejo boa sorte com seus experimentos.