Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar as proteínas fluorescentes M orange dois e andron como marcadores ópticos duplos para rotular seletivamente quatro populações celulares individuais ou compartimentos celulares. Isso é alcançado primeiro iluminando as células com luz de excitação de baixa intensidade em 488 nanômetros para desativar toda a fluorescência verde desenhada. Como segundo passo, as células são expostas à luz de excitação de alta intensidade em 488 nanômetros, que fotoconverte a fluorescência de M orange para vermelho.

Em seguida, as células são expostas à excitação de dois fótons em 800 nanômetros para ativar a fluorescência de dral. Mais uma vez, os resultados obtidos demonstram que é possível marcar células em quatro combinações distintas com base no realce óptico dual com M Orange dois e drawn ppa. A principal vantagem deste procedimento em relação a experimentos existentes, como a fracionamento subcelular, é que ele é realizado em células vivas.

Este procedimento pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia das células beta, como por que apenas uma pequena fração das vesículas de insulina é secretada. Embora este procedimento possa fornecer informações sobre a função das células beta, ele também pode ser aplicado a outros sistemas. Por exemplo, o rastreamento de células cancerígenas in vivo, uma amostra de gotículas de proteína fluorescente consiste em uma emulsão aquosa octal com uma proteína fluorescente localizada na fase aquosa.

Essa emulsão é colocada entre uma lâmina de microscópio e um lamínula quadrado de 22 milímetros para aplicações de microscopia. No início deste procedimento, as lâminas e os lamínulas devem ser limpos e revestidos com um agente hidrofóbico. Limpe o material de vidro lavando-o por cinco minutos com acetona.

Após a lavagem, deixe o material de vidro secar ao ar. Em seguida, prepare uma solução de selene 2% metil trimetóxi em acetona e recubra o material de vidro com a solução por dois minutos. Após o revestimento, remova o material de vidro da solução e deixe secar.

Em seguida, enxágue a vidraria com etanol 70% de um frasco pulverizador. Após a lavagem, deixe a vidraria secar ao ar novamente e remova qualquer líquido remanescente. Utilizando ar pressurizado, a vidraria revestida pode ser armazenada por pelo menos um mês.

Uma vez que o material de vidro tenha sido preparado, obtenha proteínas fluorescentes previamente purificadas como proteína com marcação his proveniente de e coli. Meça o espectro de absorção da proteína purificada. Prepare uma diluição estoque com densidade óptica de aproximadamente 0,1 em solução de salina tamponada com tris com pH oito contendo 0,1% de albumina de soro bovino.

Adicionalmente, prepare 10 mililitros de uma mistura um para um de um octal e solução salina tamponada com tris em um tubo cônico de 15 mililitros e misture vigorosamente. Após a mistura, deixe o conjunto até que a separação de fases esteja completa. A fase superior é o octal; para preparar a emulsão, pipete 45 microlitros de um octal e cinco microlitros de proteína fluorescente em um tubo epi ou orph.

Toque no tubo algumas vezes para iniciar a formação da emulsão, depois sonique o tubo por 30 segundos em um banho de ultrassom. Enquanto isso, prepare uma lâmina de microscópio revestida e uma lamínula, prontas para uso após a sonicação. A emulsão deve ficar completamente opaca.

Pipete imediatamente quatro microlitros da emulsão do centro do tubo sobre uma lâmina de microscópio revestida e cubra-a com um lamínula revestido. A emulsão deve espalhar-se uniformemente entre a lâmina de microscópio e o lamínula. Em poucos minutos, a amostra deverá estar estável.

O procedimento a seguir é uma estratégia geral para configurar um experimento de fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Este procedimento pode ser aplicado tanto a proteínas purificadas quanto a células vivas. Neste experimento, uma amostra em gota contendo a proteína m orange dois purificada é utilizada como ponto de partida geral para o experimento de fotoconversão.

Configure o microscópio confocal de varredura a laser da seguinte maneira. Utilize um objetivo de imersão a óleo com abertura numérica de 40 x 1,3 e um tamanho de imagem de 512 por 512 pixels. Ajuste o tempo de permanência do pixel para seis microssegundos, o zoom para quatro e aumente o tamanho do pinhole para corresponder a uma resolução Z de três mícrons.

Configure dois canais de detecção para a fluorescência inicial e convertida por fotoconversão, bem como um canal de fotoconversão. Observe as espécies laranjas utilizando luz de excitação de 561 nanômetros e colete a fluorescência entre 570 e 630 nanômetros. Detecte as espécies vermelhas fotoconvertidas utilizando luz de excitação de 633 nanômetros e colete a fluorescência entre 640 e 700 nanômetros.

Para o canal de conversão fotográfica, selecione a linha do laser de 488 nanômetros e colete a fluorescência entre 490 e 540 nanômetros. Imagem. O canal de conversão fotográfica não é estritamente necessário, mas pode ser útil. Para iniciar o experimento, utilize o canal do detector para obter a fluorescência inicial com varredura contínua, ajustando a potência do laser e o ganho do detector para obter qualidade de imagem ideal.

Em seguida, ative o canal de fotoconversão e selecione a baixa potência do laser. Inicie a aquisição de uma série de imagens em lapso de tempo e aumente gradualmente o laser de fotoconversão até que um clareamento significativo da fluorescência inicial seja observado. Continue a varredura até que a fluorescência inicial esteja aproximadamente 75% clareada.

Em seguida, desative o canal de fotoconversão e ative o canal de detecção da fluorescência fotoconvertida. Inicie a aquisição de imagens com alto ganho do detector e baixa potência do laser. Aumente gradualmente a potência do laser até que a fluorescência fotoconvertida seja detectada.

Uma vez detectado, ajuste a potência do laser e a detecção ou ganho para obter a qualidade de imagem ideal. Por fim, otimize a potência do laser utilizada para a fotoconversão, bem como sua duração. O aumento da potência do laser acelerará a taxa de fotoconversão.

No entanto, uma potência de laser excessiva causará fotobranqueamento da proteína. Uma vez determinadas a conversão fotoquímica ideal, a potência e a duração do laser, esses parâmetros podem ser utilizados para configurar um módulo padrão de fotobranqueamento ou um módulo de recuperação da fluorescência após fotobranqueamento. Em seguida, o canal de conversão fotoquímica não será mais necessário devido às propriedades espectrais de deslocamento para o vermelho da M laranja dois.

Pode ser usado em combinação com a proteína fluorescente verde comutável pela luz desenhada PU para marcação óptica com dupla sonda. Para iniciar a marcação óptica com dupla sonda, cultive células HeLa em placas com fundo de vidro. Transfete as células com plasmídeos que codificam as proteínas fluorescentes 24 horas antes da aquisição de imagens, utilizando um transfeção padrão com LIPECTOMY 2000.

Coloque as células vivas em um microscópio confocal de varredura a laser e configure o microscópio para a conversão com duas fotos de M orange conforme descrito anteriormente. Em seguida, configure o microscópio para a comutação fotônica de DPA. O DPA é excitado com luz de 488 nanômetros e sua fluorescência pode ser visualizada utilizando o canal de conversão com duas fotos de M orange.

Certifique-se de minimizar a potência do laser utilizada para a imagem de MPA, pois uma potência excessiva causará a inativação de mpa. Adicione um canal para a fotoativação de MPA utilizando excitação por dois fótons a 800 nanômetros. Posteriormente, determine a potência do laser necessária para a imagem da fotoativação e da foto inativação da fluorescência de OFA.

Um dos aspectos mais difíceis deste procedimento é inativar a RPA sem fotoconverter a M laranja. Como ambos os eventos ocorrem no mesmo comprimento de onda, é muito importante otimizar cuidadosamente a fotoconversão para evitar isso.

Potência e duração do laser: Tenha cautela quanto à fotoconversão da M laranja dois. Uma inativação do PU ambos ocorre após excitação com luz de 488 nanômetros para inativar o PU sem fotoconversão significativa da M laranja dois. Utilize uma potência de laser mais baixa uma vez que os parâmetros para fotoconversão da M laranja dois e comutação fotoativa do DPA forem definidos.

Pode-se obter realce óptico com dupla sonda. Primeiro, inative a fluorescência de DPA em todo o campo de visão com excitação de baixa potência em 488 nanômetros. Em seguida, selecione uma região de interesse e converta a m laranja dois com excitação de alta potência em 488 nanômetros.

Por fim, selecione uma região de interesse e ative a fluorescência do DPA utilizando excitação por dois fótons a 800 nanômetros. As amostras de gotículas de proteína fluorescente são particularmente adequadas para a configuração de aplicações de fotoconversão em microscopia confocal. Quando a amostra de gotículas é preparada corretamente, as gotículas aparecem muito homogêneas.

No entanto, quando a amostra é preparada sem revestir a lâmina do microscópio com uma lamínula, as gotículas tendem a ser esmagadas contra uma das superfícies de vidro nas amostras preparadas. Na ausência de BSA 0,1%, a proteína fluorescente tende a se acumular na interface octanal-água. A criação de um halo de fluorescência por fotoconversão depende criticamente da potência do laser e da duração da exposição.

Uma potência de laser excessiva ou um tempo de exposição muito longo causará fotobranqueamento e resultará na redução da fluorescência vermelha fotoconvertida. As propriedades espectrais distintas de M laranja dois e PHO permitem o realce óptico dual com duas sondas antes da fotoconversão. Células que expressam M laranja dois, histona H dois B e DPA mito apresentam fluorescência laranja no núcleo e fluorescência verde nas mitocôndrias. Quando toda a fluorescência é desativada com excitação de baixa potência em 488 nanômetros, ocorre uma fotoconversão mínima de M laranja.

Dois M laranja dois podem então ser fotoconvertidos em vermelho com excitação de alta potência em 488 nanômetros. Uma vez que M laranja dois tenha sido fotoconvertido, a fluorescência do desenho pode ser reativada usando excitação de dois fótons em 800 nanômetros. Com a marcação óptica de dupla sonda, as células podem ser rotuladas de quatro maneiras distintas.

Utilizando esta técnica, é possível rotular especificamente quatro populações celulares diferentes. Como você viu, um dos aspectos mais difíceis deste procedimento é inativar o MPA sem fotoconverter a mOrange. Uma vez dominado, experimentos adicionais podem ser realizados usando este sistema, por exemplo, o rastreamento de múltiplas populações em células beta pancreáticas.

É isso aí. Espero que você tenha achado esta apresentação útil e desejo boa sorte com seus experimentos.