Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano
16 de junho de 2010
Estímulo evocado [Ca 2 + Sinais] i de espermatozóides humanos individuais são avaliados. Células móveis são carregados com Ca 2 + Sensíveis ao corante fluorescente (AM-éster de método) e imobilizada em uma câmara perfusable. Células são gravadas por lapso de tempo de microscopia de fluorescência e estimulado através do meio de perfusão. Respostas de células individuais (ou regiões) são analisados off-line usando o Excel.
O objetivo geral deste procedimento é obter séries de imagens de espermatozoides humanos imobilizados marcados com um corante fluorescente de cálcio. Primeiro, células móveis são isoladas do plasma seminal por meio de ascensão ativa para o meio de incubação. Após a capacitação, as células são marcadas com um indicador fluorescente de cálcio, em seguida transferidas para uma câmara de imagemamento fundível, que é montada em um microscópio de fluorescência invertido.
As respostas da concentração de íons cálcio são capturadas como uma série de imagens com lapso de tempo e analisadas para extrair respostas de células individuais. Olá, sou Edwin Andres Morales Garcia do laboratório do Dr. Steven J. Public Cova na Escola de Ciências da Vida da Universidade de Birmingham, Reino Unido. Sou Katherine Nash, também do Public Overlap.
E eu sou Jennifer Morris do Public Overlap. Hoje mostraremos o seu procedimento para imagear respostas intracelulares de cálcio em células individuais de esperma humano. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a regulação das atividades espermáticas usando estímulos derivados do óvulo e do trato feminino.
Então vamos começar. Armazene as amostras de sêmen a 37 graus Celsius por não mais de 30 minutos a partir do momento da coleta para isolar as células móveis do plasma seminal. Adicione um mililitro de solução salina balanceada de L'S suplementada com 0,3% de BSA, abreviada como S-E-B-S-S, em uma série de tubos de poliestireno de cinco mililitros com fundo redondo. Sobreponha suavemente o S-E-B-S-S em cada tubo com 0,3 mililitros de sêmen e tampe o tubo levemente.
Incube os tubos em um ângulo de 45 graus por uma hora a 37 graus Celsius e 6% de dióxido de carbono. Para permitir que as células móveis nadem para dentro do S-E-B-S-S, pipete cuidadosamente os 0,7 mililitro superiores da solução e transfira a solução de todos os tubos para um tubo cônico limpo de 15 mililitros de poliestireno. Agite suavemente para homogeneizar e conte as células que foram imobilizadas com formalina em uma nova câmara de contagem.
Leve a concentração a 6 milhões de células por mililitro em S-E-B-S-S e divida o esperma em alíquotas de 200 microlitros em tubos de poliestireno de cinco mililitros com fundo redondo. Tampe levemente. Se a resposta de células capacitadas estiver sendo estudada, incube os tubos por cinco a seis horas a 37 graus Celsius e 6% de dióxido de carbono para permitir a capacitação. Aplique 10 microlitros de polilisina a 10% em forma de várias gotas pequenas ao centro de um lamínula de 22 por 50 milímetros.
Cubra o número um com uma lamínula e deixe secar completamente. Use graxa de vácuo para fixar a lamínula com o lado tratado voltado para cima em uma câmara de imagem fundida montada. Para esse fim.
Para cada experimento de imagem, selecione um único tubo de células capacitadas e adicione 1,2 microlitros de 2,5 miligramas por mililitro de verde de órgãos dependente de cálcio dissolvido em DMSO para uma concentração final de 10 micromolares. Incube o tubo por 40 minutos a 37 graus Celsius e 6% de dióxido de carbono.
Usando um micropipetador de 200 microlitros com ponteira P200, remova completamente toda a solução do tubo. Encha a câmara injetando suavemente no orifício de entrada. Incline a câmara para que as bolhas escapem pelo orifício de saída.
Coloque a câmara inteira no incubador e incube por mais 20 minutos a 37 graus Celsius e 6% de dióxido de carbono. Para permitir que os espermatozoides adiram à poli-D-lisina. Monte a câmara no microscópio fluorescente invertido e conecte-a ao aparelho de perfusão.
Deixe a preparação no escuro por pelo menos 10 minutos para permitir que a perfusão seja removida. Observe as células soltas e o material extracelular morto em contraste de fase com aumento de 40x ou 60x; escolha um campo de visão onde o espaçamento celular seja suficiente para permitir que a fluorescência de cada célula seja avaliada separadamente. As células devem estar adequadamente aderidas, mas preferencialmente exibindo atividade de fledger clara.
Altere o microscópio para o canal de fluorescência verde. Mantenha os tempos de exposição no mínimo necessário para uma imagem fluorescente nítida. Para reduzir o fotodesvanecimento no software IQ.
Ative a aquisição de imagens em série temporal. Adquira imagens a 0,1 hertz e utilize um obturador controlado por software para limitar a iluminação. Após um período inicial de gravação de controle de três a cinco minutos, manipule a concentração de cálcio no salino e aplique fármacos alterando o salino no cabeçote do sistema de perfusão.
Observe o momento em que cada estímulo é adicionado ao cabeçalho e calcule seu tempo de chegada na câmara conforme descrito na parte escrita deste protocolo. Para analisar as imagens offline, utilize uma das ferramentas de desenho para delinear uma região de interesse ou ROI ao redor de cada célula ou parte de uma célula — neste caso, a cabeça posterior do espermatozoide, pois o cálcio armazenado é mobilizado nesta área. Utilize a barra de rolagem para verificar a série de imagens.
Identifique e remova células que não permanecem totalmente dentro da ROI, que sobrepõem outras células ou que apresentaram aumento acentuado e rápido seguido por queda acentuada na intensidade de fluorescência, característica da morte celular. Utilize a função de análise para gerar uma série temporal de intensidade de fluorescência para cada ROI. Os dados podem então ser exportados e analisados em uma planilha.
Essas imagens são de uma série obtida durante a estimulação com três micromolares de progesterona. A linha inferior foi revestida com cores pseudocromáticas. Para ilustrar melhor as alterações relativas de intensidade, a progesterona entrou aqui na câmara.Aqui.
Esses resultados são animados em um vídeo com lapso de tempo. Observe o pico rápido na intensidade da fluorescência seguido por um aumento lento, indicando mudanças correspondentes nos níveis intracelulares de cálcio. Esses dados são quantificados aqui a partir das intensidades médias da região posterior da cabeça de três células.
Três micromolares de progesterona foram adicionados no momento indicado pela seta. A linha tracejada mostra a fluorescência média do controle. Hoje mostramos a você como isolar células de boa qualidade, carregá-las com um corante sensível ao cálcio e monitorar a resposta de células individuais à estimulação.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de utilizar a melhor população celular possível, minimizar a iluminação das células para evitar danos fototóxicos e escolher o corante que melhor se adapte às respostas que você está analisando. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este estudo avalia sinais de concentração de íons cálcio induzidos por estímulo em espermatozoides humanos individuais utilizando microscopia de fluorescência com lapso de tempo. As células espermáticas móveis são carregadas com um corante fluorescente sensível ao cálcio e imobilizadas para imageamento e análise.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia da Reprodução
Contexto
- A sinalização de cálcio desempenha um papel crucial na função espermática e na fertilização.
- O entendimento da dinâmica do cálcio pode fornecer informações sobre a regulação e a atividade espermáticas.
- Corantes fluorescentes são comumente utilizados para visualizar os níveis intracelulares de cálcio.
- A microscopia com intervalos de tempo permite a observação de respostas celulares dinâmicas.
Objetivo do Estudo
- Isolar espermatozoides humanos móveis e avaliar suas respostas de cálcio a estímulos.
- Desenvolver um método para imageamento e análise da dinâmica de cálcio em células espermáticas individuais.
- Aprimorar o entendimento do comportamento espermático em resposta a estímulos derivados do óvulo.
Métodos Utilizados
- Isolamento de espermatozoides móveis do plasma seminal utilizando a técnica de nado ascendente.
- Carregamento de espermatozoides com um corante fluorescente sensível ao cálcio.
- Imobilização de espermatozoides em uma câmara de imagemagem perfusível.
- Microscopia de fluorescência com lapso de tempo para capturar alterações na concentração de íons cálcio.
Resultados Principais
- As respostas de cálcio foram gravadas com sucesso em células espermáticas individuais.
- A estimulação com progesterona resultou em picos observáveis na intensidade de fluorescência.
- A análise dos dados revelou alterações significativas nos níveis intracelulares de cálcio.
- Os resultados foram visualizados em formato de vídeo com lapso de tempo para maior clareza.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para estudar a sinalização de cálcio em espermatozoides humanos.
- Compreender a dinâmica do cálcio pode contribuir para a biologia reprodutiva e a pesquisa em fertilidade.
- Estudos futuros podem explorar diferentes estímulos e seus efeitos na função espermática.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem da sinalização intracelular de cálcio em espermatozoides humanos fornece um indicador funcional para avaliar a motilidade espermática e o potencial de fertilização, que são pontos finais críticos nos diagnósticos de infertilidade masculina e no desenvolvimento de contraceptivos. Este método permite a desmistificação mecanicista de compostos que visam canais iônicos ou vias de sinalização específicas dos espermatozoides, medindo diretamente as respostas fisiológicas em um sistema relevante para a doença. A abordagem apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios em programas de saúde reprodutiva, fornecendo dados quantitativos em nível de célula única sobre o fluxo de cálcio induzido por estímulos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à modulação de canais iônicos espermáticos e vias de sinalização intracelular.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao confirmar o engajamento funcional do alvo em espermatozoides humanos sob condições de capacitação.
- Valor Preditivo: Gera dados de resposta dose-dependente que orientam a identificação e priorização de compostos líderes com base na modulação do fluxo de cálcio.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Produz suspensões de espermatozoides humanos validadas e carregadas com corante, adequadas para triagem fluorescente de alto conteúdo.
- Saída Quantitativa: Fornece medidas de intensidade de fluorescência em lapso de tempo que permitem o cálculo da % de alteração em relação à linha de base para avaliação comparativa de compostos.
- Reprodutibilidade: Protocolos padronizados de carregamento e perfusão apoiam a geração consistente de dados entre experimentos e laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Utiliza espermatozoides humanos como modelo translacional direto para estudar mecanismos de infertilidade e ação contraceptiva.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Relaciona a exposição ao composto com respostas funcionais de cálcio, reduzindo a ambiguidade no mecanismo de ação.
- Continuidade Translacional: Conecta achados in vitro a resultados fisiológicos mediante a medição de sinalização em tempo real em espermatozoides móveis e capacitados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, especialmente para programas focados em alvos do trato reprodutivo, onde ensaios funcionais de espermatozoides são preditivos da eficácia in vivo.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre alvos específicos dos espermatozoides por meio da associação entre exposição ao ligante e dinâmica intracelular de cálcio.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de condições controladas de carregamento com corante, perfusão e aquisição de imagens, que garantem leituras de fluorescência reprodutíveis.
- Análises: Fornece dados de fluxo de cálcio com resolução temporal em nível de célula única, permitindo a comparação entre condições de estimulação e efeitos de compostos.
- Pesquisa Translacional: Utiliza espermatozoides humanos para manter a relevância fisiológica, apoiando a transição do entendimento mecanicista para a validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação dos efeitos de compostos na função espermática em múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na modulação do alvo ao fornecer evidência direta de alterações na sinalização de cálcio em células humanas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de isolamento celular, carregamento com corante e perfusão.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados funcionais que reduzem a dependência de biomarcadores substitutos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em efeitos demonstrados na sinalização de cálcio em espermatozoides.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de espermatozoides, microscopia de fluorescência e análise de imagens para garantir a qualidade dos dados.
- Depende de sistemas de perfusão e microscópios invertidos capazes de aquisição em lapso de tempo com mínima fototoxicidade.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao preparo celular, concentração do corante e tempo de estimulação para assegurar comparabilidade.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização das condições de adesão e dos protocolos de carregamento do corante.
- As limitações práticas incluem eficiência no carregamento do corante e riscos de fotodesbotamento, que são reduzidos mediante o uso de corantes em comprimentos de onda visíveis e iluminação controlada.
