Western Blotting de Amostras de DNA Digerido Contendo Ligações Cruzadas DNA-Proteína (DPCs)

Para iniciar o western blotting das amostras de DNA digeridas normalizadas, adicione 4X tampão de amostra Laemmli e ferva a amostra por cinco minutos. Carregar cinco a seis microgramas de amostra digerida em gel de poliacrilamida a 4 a 20% e executar SDS-PAGE para resolver modificações não modificadas e pós-traducionais ou DPCs conjugadas PMT. Incubar o gel com coloração de azul de Coomassie durante a noite à temperatura ambiente.

Lavar o gel com água bidestilada por duas horas antes da aquisição das imagens. Para detectar ubiquitilação, modificação SUMO-1 ou SUMO-2 e 3, ribosilação ADP, TOP1 total, TOP2 alfa ou TOP2 beta DPCs, diluir os anticorpos correspondentes, conforme mostrado na tabela. Em seguida, transfira o gel em uma diluição apropriada de anticorpo primário em tampão de bloqueio e incube as membranas durante a noite a quatro graus Celsius.

Uma vez feito, incubar a membrana lavada PBST com um anticorpo secundário diluído 5.000 vezes em tampão de bloqueio por 60 minutos à temperatura ambiente antes de desenvolver a membrana com reagente de quimioluminescência aprimorado. Adquira uma imagem usando o sistema de imagem. A exposição à camptotecina induziu a formação de DPCs TOP1.

A formação de DPCs TOP1 atingiu o pico após 20 minutos de exposição à camptotecina, semelhante à modificação anti-SUMO-2 e 3. O ápice da modificação e ubiquitilação do SUMO-1 também foi observado. As CPDs e suas modificações SUMO-2 e 3 TOP1 diminuíram de forma dependente da dose de camptotecina.

As DPCs TOP2 induzidas por adipócitos e a modificação SUMO-2 e 3 atingiram o pico em 20 minutos e depois diminuíram. Em comparação, as modificações de SUMO-1 e ubiquitina atingiram o pico em 60 minutos. As DPCs induzidas por formaldeído e seus SUMO-2 e 3, SUMO-1 e ubiquitilação formaram-se e acumularam-se de forma dose-dependente.

A detecção quantitativa de PARilação de DPCs TOP1 usando um anticorpo anti-PAR, TOP1 DPC PARylation não foi detectável a menos que um inibidor de PARG fosse adicionado à célula, sugerindo que PARylation transpira prontamente e é altamente dinâmico.