drosófila Ensaio de escavação e tunelamento: um método para avaliar a hipóxia tecidual em larvas de moscas

- Para montar a gaiola de coleta de embriões, use placas de ágar suco de uva suplementadas com pasta de fermento fresco e coloque as placas em gaiolas contendo moscas Drosophila machos e fêmeas do genótipo apropriado. O odor do fermento e do suco de uva é atraente e promove a postura de ovos pelas fêmeas. Permitir a postura dos ovos por um período cronometrado. Em seguida, remova os adultos e incube as placas embrionárias por 24 horas para obter as larvas de primeiro ínstar. Em seguida, transfira suavemente algumas larvas individuais do prato de suco de uva para uma placa de teste somente de ágar, onde um orifício no ágar no centro do prato foi cortado e preenchido com pasta de fermento.

As larvas jovens devem se alimentar para ganhar peso corporal para se desenvolver, então elas se enterram na fonte de alimento, a pasta de fermento. À medida que se desenvolvem, as larvas entram em uma fase errante e se afastam do alimento para procurar um local para a pupação. Para avaliar a hipóxia, examine os padrões de tunelamento que as larvas formam no substrato. A falta ou insuficiência de tunelamento é um sinal de privação de oxigênio. No protocolo de exemplo, veremos como configurar o ensaio de escavação e tunelamento.

- Configure os cruzamentos genéticos de controle e experimentais em pratos de postura de ovos, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha as moscas na escuridão por pelo menos dois dias antes de iniciar as coletas de ovos cronometradas. Para a coleta cronometrada de ovos, transfira os adultos para novos pratos de ágar uva decorados com uma mancha fresca de pasta de fermento no início do dia e deixe os adultos colocarem ovos nos pratos por quatro horas. Após quatro horas, transfira os adultos para placas de ágar uva fresca.

Em seguida, incube as placas de coleta de quatro horas durante a noite a 25 graus Celsius. Na tarde seguinte, a maioria das larvas terá eclodido. Planeje ter pelo menos 50 para cada grupo experimental.

Para uma única execução do ensaio, prepare pelo menos cinco placas de ensaio por grupo experimental. Adicione 16 gramas de ágar mosca em 700 mililitros de água deionizada por aquecimento. Prepare 17,5 mililitros de Nipagen em etanol a 95%. Aqueça a solução de ágar até que esteja quase completamente dissolvida. Em seguida, adicione a solução de Nipagen à solução de ágar e aqueça até que o ágar se dissolva completamente. Resfrie a solução de ágar brevemente e, em seguida, carregue placas de 10 centímetros com 15 mililitros da solução de ágar. Assim que o ágar gelificar, coloque as tampas nos pratos e deixe-os secar em temperatura ambiente por algumas horas ou durante a noite.

O ágar curado deve ser firme ao toque e resistir ao desmoronamento quando os pedaços são cortados. Depois que o ágar estiver curado, use uma broca de cortiça de 1,5 centímetro para fazer um orifício central no gel de ágar em cada placa. Em seguida, preencha os buracos cuidadosamente com pasta de fermento fresco.

Para transferir as larvas para a placa de ensaio, faça uma ferramenta simples. Dobre uma curva na ponta de uma microespátula de plástico e mergulhe a ponta em pasta de fermento para torná-la adesiva às larvas. Agora pegue as larvas do primeiro ínstar individualmente e coloque-as no prato de ágar perto do monte de comida. Para cada grupo experimental, prepare pelo menos cinco placas cada uma com 10 larvas.

Para garantir a reprodutibilidade entre as réplicas do ensaio, é fundamental que apenas 10 larvas sejam colocadas em cada placa de ensaio. Certifique-se de verificar cuidadosamente a placa de ensaio para determinar se uma e apenas uma larva é transferida cada vez que você entrega uma larva com a ponta da microespátula.

Assim que o prato estiver carregado, etiquete-o, cubra-o e coloque-o no escuro com a tampa voltada para cima em temperatura ambiente. Examine cada placa diariamente até que todas as larvas tenham morrido ou se transformado em pupa. Aqui estão exemplos de placas para uma cepa do tipo selvagem do segundo ao oitavo dia do ensaio. No segundo dia, as larvas são enterradas na comida e não ocorre tunelamento. O tunelamento começa no terceiro dia e atinge o máximo entre os dias cinco e oito, quando as larvas param de vagar e se transformam em pupas em seus túneis.

Transfira cuidadosamente as pupas com uma agulha de provocação dobrada para um prato de uva e, se desejar, conte quantas pupas fecham. Observe a formação de pupas e avalie as pupas quanto a anormalidades.