Name: Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Aprenda a inocular colônias de bibliotecas metagenômicas em filtros de membrana usando robótica de alta precisão. Este método permite o processamento eficiente de até 10.000 colônias por filtro para estudos genômicos avançados.

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1. Processo de hibridização Um tubo de hibridização terá 1 ou 2 membranas (tamanho 22 por 22 cm). Use 50 ml de mistura de hibridização e 0,5 mg de DNA sonda (10 concentração ng / ml final) por tubo de hibridização. Para melhores resultados, use gel de DNA purificado como sonda. Se ampliação preparação da sonda, aumentar o número de tubos em vez de aumentar a quantidade de reagentes por tubo. Sonda preparação (0,5 mg DNA): <ol><li> Diluir 15 mL de cross-linker solução com 60 mL de água. </li><li> Diluir DNA a 10 ng / mL com água a 50 mL de volume total em um microtubo com tampa de rosca. </li><li> Desnaturar DNA por 5 minutos em água fervente. </li><li> Transferir rapidamente para o gelo e deixe esfriar por 5 min. Girar por alguns instantes. </li><li> Adicionar 50 ul de tampão de reação e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 10 ml de reagente de rotulagem e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 50 ul da solução cross-linker diluída a partir do passo 1 e misture delicadamente. Vortex suavemente e girar rapidamente. </li><li> Incubar a 37 ° C por 30 min. </li><li> Manter em gelo por até 2 h ou adicionar um volume igual de 100% de glicerol e armazenar a -20 ° C. Nota: Utilize a água fornecida com o kit. Manter todos os reagentes no gelo, salvo indicação contrária. </li></ol> Preparação de membrana e hibridização <ol><li> Pré-aqueça 50 ml de tampão de hibridação e tubo de hibridação a 60 ° C. </li><li> Adicione o tampão de hibridação para o tubo de hibridização. Roll-up de membrana (s) e adicionar ao tubo de hibridização. (Se a adição de 2 membranas por tubo, primeiro rolo de uma membrana completamente, então arregaçar a membrana outros em cima na mesma direção.) </li><li> Incube o tubo de hibridação a 60 ° C por pelo menos ½ h. (Certifique-se de membrana (s) ficar encharcado completamente.) </li><li> Transferência de cerca de 1 ml de tampão de hibridação com uma pipeta longo do tubo de hibridização para o tubo contendo a sonda marcada. Vortex suavemente e girar rapidamente. Transfira a mistura de volta ao tubo de hibridização. </li><li> Incubar a 60 ° C durante a noite. Nota: Use uma pinça e luvas ao manusear membranas. Misture o conteúdo dos tubos de hibridização delicadamente, pois a agitação excessiva fará com que a formação permanente de espuma indesejável. Membranas devem ser adicionados em condições molhadas; mergulhar em tampão de hibridação ou água se necessário e drenar o excesso de líquido antes de acrescentar. </li></ol> 2. Procedimento de detecção Membranas de lavar <ol><li> Pré-aqueça o tampão de lavagem principal a 60 ° C. (Use o forno microondas e / ou placa de aquecimento.) </li><li> Se houver 2 membranas em um tubo de hibridização, a transferência de uma membrana para um ambiente limpo, pré-aquecido tubo de hibridização, vazio. </li><li> Brevemente lavar tubo de hibridização com cerca de 50 ml de tampão de lavagem primária. </li><li> Adicionar cerca de 100 ml de tampão de lavagem primária para tubo de hibridização e incubar a 60 ° C por 10 min. </li><li> Repita o passo 3 e 4. </li><li> Transferência de membrana para lavagem de contentores e incubar com pelo menos 250 ml de tampão de lavagem secundária em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Repita a etapa 6. Nota: As membranas podem ser mantidos no tampão de lavagem secundária em temperatura ambiente por até ½ h antes da geração do sinal. </li></ol> Geração de sinal e detecção (procedimento de uma membrana) <ol><li> Dois pedaços de fita SaranWrap flat para o tampo da mesa (uma para o passo 2 e um para a etapa 4). </li><li> Cuidadosamente drenar o tampão em excesso da membrana, tocando os cantos da membrana contra a lateral do recipiente e transferência da membrana para o SaranWrap (lado da amostra para cima). </li><li> Despeje 07/06 ml de reagente ECF sobre a membrana e enrole vezes Saran mais de membrana. Cuidadosamente distribuir ECF reagente sobre a membrana suavemente movendo um Kimwipe sobre o SaranWrap. Incubar por 5 min. </li><li> Drenar o excesso de reagente ECF da membrana e transferi-lo para novas SaranWrap, embrulhe vezes ao longo da membrana, e selar as bordas com fita adesiva. Cobrir a membrana com papel alumínio. Incubar por 1-2 horas. </li><li> Prepare o vidro do scanner através da distribuição de 1-2 ml de reagente ECF sobre a placa de vidro. Em seguida, transferir a membrana para a placa de vidro (lado da amostra para baixo) e distribuir outra ml de reagente ECF 02/01 sobre a membrana. Sobreposição com SaranWrap e empurre cuidadosamente todas as bolhas de ar longe da membrana. (Você pode colocar uma placa rígida em cima da membrana SaranWrap manter pressionada contra a placa de vidro.) </li><li> Use o Fuji FLA-5100 scanner de fluorescência (&quot;1 laser 1 imagem&quot; mode) com as seguintes configurações: excitação 473 nm, a detecção de filtro LPB (510 nm), resolução de 50 mm, graduação sinal de 16 bits, CH1 400 V. (Scan leva cerca de 15-20 minutos por membrana de tamanho 22 por 22 cm.) Opcional: </li><li> Deixe descansar por 2-4 horas (ou mais). </li><li> Repita scan como no passo 6. </li></ol> 3. Stripping e armazenamento de procedimento (NUF versão) <ol><li> Transferência de membrana para 100% ethanol e incubar em temperatura ambiente por 10 min com agitação suave. </li><li> Substituir com etanol 100% frescos e incubar overnight em temperatura ambiente. (Membrane pode permanecer em etanol por vários dias.) </li><li> Substituir de etanol com água destilada e incubar em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Adicione 100 ml de água e 5 ml de 10% SDS (final SDS 0,5%) a um tubo de hibridização e misture delicadamente. Adicionar membrana. </li><li> Incubar a 80 ° C por 1 h. </li><li> Transferência de membrana para um recipiente limpo e vazio. </li><li> Adicione 500 ml de água e 5 ml de SDS 10% (final SDS 0,1%) e um copo de calor a uma fervura vigorosa no forno de microondas. </li><li> Despeje o próximo ponto de ebulição 0,1% SDS solução sobre a membrana e agite suavemente por alguns minutos. Deixe esfriar até a temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe em pelo menos 250 ml de estéril 100 mM Tris pH 8 por pelo menos 10 min. </li><li> Enrole membrana em SaranWrap e bordas cuidadosamente estreita com fitas. Armazenar a 4 ° C. (Membranas nunca deve secar.) </li></ol>

O procedimento de stripping não foi otimizado. No entanto, o procedimento de stripping dada na instrução do fabricante (2 lavagens cada uma, 10 min em etanol 100%, uma lavagem de 1 hora a 60 ° C em 0,5% SDS) é insuficiente. Pelo menos de incubação durante a noite em etanol a 100% é necessário para dissolver o produto da reação ECF; de incubação de vários dias em etanol 100% parece não ter efeitos adversos sobre a capacidade de reprobe da membrana. Tratamento do fabricante SDS também parece ser insuficiente. NUF tentou 1 hora a 80 ° C com 0,...

Combinação pacote RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

grande escala telas de bibliotecas metagenomic

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic bibliotecas fragmentos contíguos grande arquivo de seqüências genômicas de microrganismos de cultivo sem a necessidade de prévio. Gerando um procedimento simplificado para a criação de bibliotecas e triagem metagenomic é, portanto, útil para eficiente de alto rendimento investigações sobre as propriedades genéticas e metabólicas dos agenciamentos microbiana inculta. Aqui, protocolos de chave são apresentados em vídeo, o que propomos é o formato mais útil para descrever com precisão um longo processo que depende alternadamente instrumentação robótica e intervenções (humano) manual. Primeiro, nós empregada robótica para detectar clones biblioteca para as membranas de alta densidade macroarray, cada um dos quais pode conter colônias duplicar 20-4 biblioteca placas de 384 poços. Automação é essencial para este procedimento não só quanto à precisão e velocidade, mas também devido à miniaturização de escala necessária para atender o grande número de clones de biblioteca em alta densidade arranjos espaciais. Uma vez gerado, o próximo demonstrou como as membranas macroarray podem ser selecionados para genes de interesse usando versões modificadas de protocolos padrão para rotulagem sonda, hibridação da membrana e detecção do sinal. Complementou-se o demonstração visual desses procedimentos com descrição escrita pormenorizada das etapas envolvidas e os materiais necessários, os quais estão disponíveis on-line ao lado do vídeo.

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Bibliotecas metagenômicas arquivam grandes fragmentos de sequências genômicas contíguas de microrganismos sem a necessidade de cultivo prévio. A geração de uma ...

Portanto, nosso objetivo aqui é inocular colônias de algumas dessas bibliotecas metagenômicas em filtros de membrana, e cada um desses filtros pode conter 10.000 colônias. O que Rums está fazendo agora é colocar esse filtro de náilon sobre um bloco e alisá-lo um pouco. Está um pouco úmido, apenas com o meio de crescimento, caldo luria.E o que ele vai fazer então é transferir essa membrana umedecida para o robô, que irá automaticamente inoculá-la com 10.000 colônias. A robótica é essencial para esse tipo de procedimento, porque nenhuma pessoa tem realmente a paciência ou a precisão necessárias para depositar 10.000 colônias sobre uma dessas membranas. Os robôs são uma das coisas que realmente impulsionaram a ciência genômica, permitindo que operações muito repetitivas e em uma escala espacial pequena sejam realizadas com alta precisão.No momento, estamos preparando o robô para alimentar essas 3 placas de 84 poços, sendo que cada poço nessas 3 placas de 84 poços contém uma colônia individual da biblioteca metagenômica. Agora, o robô está esterilizando as agulhas de inoculação que utilizará para semear na membrana. Assim, as agulhas passam por várias soluções diferentes, uma das quais é etanol a 70%, para esterilizá-las, e então essas agulhas de inoculação serão mergulhadas em uma placa de 84 poços que contém todas as colônias.Agora está sendo esterilizado e secado pela luz. Após as agulhas de inoculação serem secas, uma placa será inserida no robô. Cada uma dessas colônias é na verdade transferida e duplicada, o que serve como controle.Portanto, estamos na realidade procurando duas colônias que sejam idênticas para mostrar um sinal da hibridização. Depois que todas as colônias tiverem sido depositadas no filtro, novamente, ele é aplicado à placa com augurônio que você vê aqui e, em seguida, é mantido a 37 graus C durante a noite.O que acontece é que as colônias crescem e o que se vê disposto em matriz são 10.000 colônias em um filtro. É claro que cada uma dessas colônias possui muitas, muitas, muitas cópias do DNA recombinante, no caso, o DNA metagenômico. Este é proveniente do Oceano Pacífico Norte Central que nós obtivemos.O que Saltram fará em seguida é transferir essa membrana para uma série de soluções. A primeira solução para a qual ele transfere é uma solução básica de hidróxido de sódio, e isso vai lisar as colônias. Essencialmente, dissolve a parede celular e libera o DNA, permitindo que o DNA entre em contato com o filtro.E então, o que está acontecendo aqui é que todas as paredes celulares de todas as bactérias nessas colônias estão se dissolvendo e o DNA agora está livre. Após cinco minutos em hidróxido de sódio, os filtros são então transferidos. Este é apenas um local para repousá-los porque em seguida eles irão para o vapor fervente.Então, esta é a segunda etapa do processo de lise. Primeiro, as células foram tratadas com uma solução altamente básica de hidróxido de sódio e o detergente dodecilsulfato de sódio. Agora, essas colônias estão sendo submetidas a calor elevado, calor de vapor a cem graus Celsius.A combinação dessa base e do detergente com esse calor irá lisar completamente as células e o DNA ficará livre sobre o filtro. Após cinco minutos no vapor do ER, o pescoço irá transferir esse filtro para uma solução neutralizante. A solução neutralizante basicamente neutraliza toda essa base e, em seguida, o filtro será seco.Agora esta é a solução neutralizante, e permanece nesta solução por mais cinco minutos. Em seguida, o filtro é transferido para papel de blot e deixado secar, normalmente durante a noite. Após as membranas com as células lisadas terem sido secas durante a noite, são colocadas em uma solução de triss, EDTA e protease K, sendo que a protease K tem a função de remover todas as proteínas presentes na membrana.Você vê que a placa foi virada para garantir que todas aquelas colônias sejam recobertas com a protease K. Isso vai digerir grande parte do material celular extranícuo e das proteínas. Após uma incubação de meia hora com protease K a 37 graus C, as membranas são simplesmente retiradas da solução e secas em papel absorvente durante a noite. Em seguida, estão prontas para o próximo passo, que é a hibridização.Meu nome é Vin fm. Sou pós-doutorando no Laboratório de Delong. No MIT, utilizo a tecnologia de macroarranjo para triagem de marcadores filogenéticos e também de genes funcionais.Você viu como essas bibliotecas de matrizes macro foram preparadas. Vou guiá-lo pelo restante do procedimento sobre como realizar a triagem. Aqui está uma matriz macro; antes de prosseguirmos, precisamos fixar o DNA na própria membrana por meio de ligação cruzada com UV.Fazemos isso com um ligador UV, colocamos ali, configuramos para ligação cruzada automática e iniciamos. Assim que a ligação cruzada for concluída, gosto de cortar as membranas ao meio. Faço isso porque essas membranas serão hibridadas dentro desses tubos de hibridização, e cortá-las ao meio permite que toda a superfície interna da membrana fique totalmente exposta à solução de hibridização.Pode-se observar que a membrana está perfeitamente posicionada dentro do tubo, sem dobrar sobre si mesma. Assim, aqui temos a membrana acomodada corretamente dentro do tubo de hibridização. Em seguida, vou adicionar o tampão de hibridização a ela.Contendo a sonda, que coloquei neste outro tubo pré-aquecido a 60 graus. Essa é minha temperatura de hibridização preferida. Então, antes de fazer isso, ou melhor, enquanto faço isso, explicarei que o tampão de hibridização foi enviado junto com o nosso kit de detecção pelo fabricante.É indicado o tampão de hibridização, ao qual acrescentamos o agente bloqueador. Também estão incluídos tampão fosfato, SDS, cloreto de magnésio e cloreto de sódio, além de um pouco de ureia. Ótimo. Então, o próximo passo é colocar este tubo, com seu tampão de hibridização, membrana e sonda, dentro da estufa de hibridização, que configurei para 60 graus, e deixá-lo em incubação durante a noite sem necessidade de monitoramento.Após, idealmente, uma incubação durante a noite, é hora de lavar as membranas para remover qualquer sonda não ligada. Não há materiais perigosos no preparo do tampão de hibridização ou da sonda. Portanto, é seguro descartá-lo pela pia.Vou pegar meu tampão de lavagem primário, que também está aquecendo a 60 graus. Ele vem se aquecendo adequadamente na mesma temperatura na qual as membranas foram hibridizadas durante a noite. Será lavado também na mesma temperatura.Então você, normalmente faço três lavagens com o tampão de lavagem primário, com cada incubação de cerca de cinco a 10 minutos. E novamente, o tampão de lavagem não contém produtos químicos radioativos nem perigosos conhecidos; após cada ciclo de lavagem, você simplesmente despeja tudo na pia também. São três lavagens com o tampão de lavagem primário a 60 graus.Agora as membranas estão prontas para a lavagem secundária, que ajusta o pH das membranas ao valor adequado para a exposição aos reagentes de detecção de ECF. Em seguida, lave as membranas em tampão de lavagem secundária à temperatura ambiente. Agora você pode usar pinças para remover as membranas ou, se for muito cuidadoso, pode usar a mão com luva, manipulando as membranas apenas pelo lado posterior ou pelas bordas, para não manchá-las com contaminantes que possam estar presentes em suas mãos, mesmo com luvas.Devemos transferir as membranas para um recipiente que contenha um tampão de lavagem secundário pré-preparado e previamente aquecido à temperatura ambiente. Coloque-as bem planas. Às vezes, as membranas podem se sobrepor, mas isso não é tão importante.Lembre-se de que esta etapa específica apenas equilibra o pH das membranas. Em seguida, deixe incubando. Você pode fazer uma leve agitação, se desejar.Não encontrei que isso seja particularmente útil ou prejudicial de maneira alguma. Então, simplesmente deixo novamente sobre minha bancada por cinco a dez minutos e, em seguida, repito a lavagem secundária pela segunda vez. A segunda lavagem da lavagem secundária está concluída.Agora é a hora de se preparar para a detecção, expandir. Então, estou esticando um pouco de filme plástico e as membranas serão colocadas sobre o filme plástico com o reagente de detecção voltado para cima das membranas e, em seguida, dobrarei o filme plástico por cima. Isso cria uma pequena bolsa ideal para conter o reagente de detecção.Aqui temos nossas membranas. Dreno qualquer excesso de tampão de lavagem sobre algumas toalhas de papel secas, uma pilha delas, e coloco as membranas sobre filme de Theran. Você tem a detecção de ECF pré-misturada.Estes geralmente podem ser armazenados no congelador por vários meses seguidos; eu simplesmente despejo os reagentes sobre a membrana. Dobrei o excesso. Então, enrolei para cobrir.E crio um pequeno compartimento, dobrando as extremidades ou as bordas, e protejo todo o processo de detecção com um pouco de folha de alumínio. Deixo isso por cerca de cinco a dez minutos também. Agora é hora de drenar os reagentes de detecção deste primeiro saco.Você percebe que eu, eu colei parte do filme aderente na minha bancada. Você, você pode achar isso útil muitas vezes para evitar o tipo de aderência que o filme plástico certamente causa. Novamente, é útil drenar pressionando suavemente sobre uma pilha de toalhas de papel e depois desenrolar sobre o filme fresco e limpo que você já preparou previamente na bancada.Ok, então os reagentes de detecção foram removidos em sua maior parte; ok, as membranas estão prontas para uma incubação de cerca de duas horas para permitir o desenvolvimento do sinal. Passaram-se duas horas e estamos prontos para detectar o sinal em nossas membranas. Para isso, utilizamos a leitura das membranas em um scanner fluorescente, manuseando-as novamente apenas pelas bordas.O que pode ser útil é usar uma pipeta para remover as bolhas que se formam entre a membrana e o vidro. Agora estamos prontos para realizar a varredura. Configure a área coberta na placa frontal pelas nossas membranas e faça a varredura em quatro e 73 nanômetros.Portanto, quando você amplia uma varredura concluída, obterá algo semelhante a esta imagem. Você tem um sinal bem aqui. Sempre que tiver dois pontos opostos, isso é um indicativo de um sinal positivo.Aqui está um exemplo, aqui está um segundo exemplo. Assim que você souber qual parte da membrana possui o sinal, você então identifica qual placa e quais poços correspondem ao sinal específico. Isso indicará qual fo smidt carrega o gene específico que você estava tentando identificar com sua triagem.E uma vez que você identifique o smid, poderá procurar por você. Uma maneira é simplesmente sequenciar todo o inserto do smid e encontrar o gene em que você está interessado.

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Research

JoVE Journal

Biology

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