Name: Medir a rigidez à flexão de células bacterianas Usando uma armadilha óptica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprenda a medir a rigidez à flexão de células de E. coli usando armadilhas ópticas. Este método permite investigar as propriedades mecânicas bacterianas e a integridade celular sob estresse mecânico.

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Reconhecemos conselhos úteis de Mingzhai Sol em células de ligação às superfícies. Agradecemos a Ned Wingreen e Zemer Gitai pelas valiosas discussões. Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health conceder P50GM07150, National Science Foundation concessão de CARREIRA PHY-0844466 e Alfred P. Sloan Foundation.

<ol><li> Cultivar células de E. coli em meio de caldo Luria-Beltrani (LB) para a fase exponencial (OD = 0,2-0,4). </li><li> Fazer crescer a cultura em LB suplementado com 50 mg / ml de cefalexina por 15 min para induzir crescimento filamentoso, e depois concentrar a cultura por 5 vezes por centrifugação. </li><li> Faça PEI revestido lamela fluindo polyethylenimine 1% diluído em água em uma câmara de fluxo, e lavar com água depois de uma incubação de 5 minutos. </li><li> O fluxo de cultura de células concentradas na câmara, e lavados com uma mistura de LB e cefalexina (50μg/mL), após 3 min para remover as células solto. </li><li> Incubar na câmara a 37 ° C por 30 min-1 hora para permitir que as células anexado crescer antes de colocar no aparelho captura óptica. </li><li> Faça polilisina revestido contas incubando contas 0,5 mícrons de diâmetro poliestireno (Bangs Labs) em polilisina 0,1% diluído em água por 30 min. Em seguida, lave as contas 3 vezes e ressuspender em água. </li><li> Diluir a solução talão por um fator de dois em LB com cefalexina (50μg/mL), e adicioná-lo na câmara de fluxo. </li><li> Opticamente armadilha um grânulo flutuante e tocá-lo para a ponta livre de uma célula. (Nós usamos uma Cidade Mad Labs estágio piezo para o controle do movimento da amostra.) Quando uma combinação adequada grânulo / célula for encontrada, lavar a câmara com cefalexina no LB (50μg/mL) para remover contas solto. </li><li> Executar custom-written programa LabView para aplicar forças de flexão para celular e força-deslocamento registro de dados. Detalhes do programa <ol class="lalpha"><li> Calibrar resposta do detector por digitalização raster anexado o talão dentro do feixe de laser de detecção e gravação 3D sinais de tensão PSD. </li><li> Identificar eixo célula longa em imagem do microscópio. </li><li> Mover células em passos em uma direção perpendicular ao eixo de células de comprimento. </li><li> Registrar a distância percorrida eo deslocamento da armadilha óptica. </li><li> Deslocamento para converter a força aplicada usando a rigidez armadilha previamente medidos e salvar o deslocamento da ponta e força para arquivo. </li></ol></li></ol> Segredos para o Sucesso: No Passo 8), é preciso encontrar uma célula com um fim bem definidos preso. Algumas células são apenas preso em uma ponta, ea força de dobra na outra ponta leva a um giro de célula inteira, em vez de dobrar. Um par adequado é encontrado dobrando cada célula rapidamente à mão usando o movimento estágio joystick controlado. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Esta figura mostra força-deslocamento de dados para uma única célula. A inclinação desta linha é a rigidez de flexão da célula.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

A produção de vídeo deste artigo foi patrocinado pela Mad Cidade Labs, que produz instrumentos utilizados nestes estudos.

O protocolo aqui apresentado foi concebido para medir quantitativamente as propriedades de dobra de células bacterianas. A configuração da experiência pode ser aplicada a qualquer célula em forma de bastonete que podem ser feitas a crescer filamentously. Temos utilizado com sucesso esta configuração para investigar os efeitos de filamentos do citoesqueleto da rigidez de flexão da E. células coli. Essa mesma técnica pode ser usada para avaliar os papéis de pressão rigidez da parede, celulares e outros componentes intracelulares na determinação da rigidez de flexão total de células.

<table><tbody><tr><td>cefalexina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polietilenimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polilisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>esferas de poliestireno com diâmetro de 0,5-&amp;mu;m</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Sistema nanoposicionador Nano-LP Series</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

medir a rigidez à flexão de células bacterianas usando uma armadilha óptica

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Nós desenvolvemos um protocolo para medir a rigidez de flexão de filamentosas em forma de bastonete. Forças são aplicadas com uma armadilha óptica, uma mola tridimensional microscópicas feitas de luz, que é formado quando uma alta intensidade do feixe de laser é focalizada em um ponto muito pequeno pela objectiva de um microscópio. Para dobrar uma célula, primeiro bind bactérias vivas para uma lamela quimicamente tratados. Como estas células crescem, o meio das células permanece ligada ao lamela, mas as extremidades de crescimento são livres desta restrição. Por induzir crescimento filamentoso com a cefalexina drogas, somos capazes de identificar as células em que uma extremidade da célula estava preso à superfície, enquanto a outra extremidade permaneceu solto e suscetível a forças de flexão. A força de flexão é aplicado com uma armadilha óptica ligando um talão polilisina revestidos para a ponta de uma célula em crescimento. Tanto a força eo deslocamento do cordão de são registrados ea rigidez de flexão da célula é a inclinação dessa relação.

Nós apresentamos um protocolo para dobrar filamentosas células bacterianas associadas a uma superfície de tampa de deslizamento com uma armadilha óptica para medir a rigidez de flexão celular.

Medir a rigidez à flexão de células bacterianas Usando uma armadilha óptica

Desenvolvemos um protocolo para medir a rigidez de flexão de bactérias filamentosas em forma de bastonete. Forças são aplicadas com uma armadilha óptica, um microscópio...

Para determinar a rigidez à flexão de células individuais de coli, primeiramente, cultive as bactérias até a fase exponencial e, em seguida, fixe-as em uma superfície de lamínula tratada quimicamente. Deixe que as células já aderidas à superfície continuem crescendo, de modo que desenvolvam extremidades flexíveis. Em seguida, introduza microesferas dielétricas, capture uma microesfera e dobre-a até a extremidade flexível de uma célula.O passo final do procedimento é curvar a célula com o armadilhamento óptico e medir os dados resultantes de deslocamento forçado. A rigidez à flexão da célula pode ser calculada por meio de um ajuste linear aos dados de deslocamento forçado. Olá, sou Steven Wong do Laboratório do Professor Joshua Shere no Instituto Louis Sickler de Genômica Integrativa e no Departamento de Física da Universidade de Princeton.Hoje vamos mostrar um procedimento para flexionar células bacterianas individuais e medir a rigidez celular. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as contribuições de diferentes estruturas intracelulares para a integridade mecânica das células bacterianas. Então, vamos começar.Para iniciar este procedimento, cultive três mililitros de células de E. coli em meio LB até a fase exponencial. Quando as células atingirem uma densidade óptica a 600 nanômetros entre 0,2 e 0,4, suplemente a cultura com 50 microgramas por mililitro de cefalexina durante 15 minutos para induzir crescimento filamentoso. Durante esses 15 minutos, monte uma câmara de fluxo.Fixe dois pedaços de fita adesiva dupla face com um espaço de três milímetros entre eles em uma lâmina de vidro e cole um lamínula por cima. O espaço entre os pedaços de fita cria um canal para o fluxo de líquido. Revesta o lamínula com PEI, introduzindo 10 microlitros de polietileno a 1% diluído em água na câmara de fluxo com uma pipeta microliterada e incube por cinco minutos.Em seguida, lave passando 200 microlitros de água por uma extremidade da câmara e coletando na outra extremidade com vácuo. Após 15 minutos de crescimento das bactérias na presença de cefalexina, centrifugue um mililitro de células em uma microcentrífuga e reconstitua em 200 microlitros de LV com cefalexina. Em seguida, novamente, use uma micropipeta em uma extremidade e vácuo na outra extremidade para passar 50 microlitros do cultivo celular concentrado para dentro da câmara contendo a lamínula revestida e incube por três minutos.Em seguida, lave com 50 microlitros de Vel B suplementado com cefalexina. Para remover as células não aderidas, incube a câmara a 37 graus Celsius por 30 minutos a uma hora para permitir que as células aderidas cresçam antes de colocá-las no instrumento de armadilha óptica enquanto as células estão em incubação. Prepare as microesferas revestidas com polilisina incubando três microlitros de microesferas de poliestireno com diâmetro de 0,5 micrômetro em uma solução de polilisina 0,1% diluída em água por 30 minutos.Quando as incubações das microesferas terminarem, lave-as três vezes centrifugando em uma microcentrífuga e ressuspendendo em um mililitro de água; em seguida, prossiga para ligar as microesferas às bactérias e meça a rigidez de ligação das células. O aspecto mais difícil deste protocolo é conseguir rec, localizar e reconhecer uma boa célula para as medições de flexão e rigidez. E uma boa célula é aquela com uma extremidade presa bem definida e uma extremidade livre.A câmara de fluxo no microscópio deve ser observada em busca de uma célula com uma extremidade bem definida e fixada. Algumas células estão aderidas apenas em uma das pontas, e a força de flexão na outra ponta leva a uma rotação completa da célula em vez de flexão. Para encontrar uma célula adequada, dobre rapidamente cada célula com a armadilha utilizando o movimento da platina controlado pelo joystick.Quando uma célula adequada for encontrada, dilua a solução de microesferas por um fator de dois em LB com cefalexina, adicione 30 microlitros da solução de microesferas à câmara de fluxo pipetando em uma extremidade e fluindo suavemente pela outra extremidade com um lenço Kimwipe; capture opticamente uma microesfera flutuante e toque-a na extremidade livre de uma célula. Lave novamente a câmara com micropipeta e utilizando um lenço Kimwipe com 50 microlitros de cefalexina em LB para remover microesferas não ligadas. Em seguida, execute um programa personalizado em LabVIEW para aplicar forças de flexão à célula e registrar os dados de deslocamento forçado.Primeiro, calibre a resposta do detector realizando uma varredura RA na esfera acoplada dentro do feixe a laser de detecção e registrando os sinais de tensão do PSD 3D. Em seguida, identifique o eixo longo da célula em uma imagem de microscópio. Após identificar o eixo longo da célula, mova a célula em etapas numa direção perpendicular ao eixo longo, ao mesmo tempo em que registra a distância percorrida e o deslocamento da esfera a partir do centro do armadilhamento óptico.Por fim, converta os valores de deslocamento em força aplicada utilizando a rigidez da armadilha previamente medida e salve. O deslocamento da ponta e a força registrados neste arquivo são dados de deslocamento forçado para uma única célula. A inclinação desta reta representa a rigidez à flexão da célula.Acabamos de mostrar como associar a rigidez à flexão de E. coli a um armadilho óptico. Ao utilizar este procedimento, é importante lembrar-se de encontrar uma boa célula com uma extremidade presa bem definida e uma extremidade livre. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Um protocolo para lançar e capturar de forma estável micropartículas dielétricas selecionadas no ar é apresentado.

Armadilha óptica carregamento de dielétrico micropartículas no ar

Muitas proteínas na célula sentem e induzem a curvatura da membrana. Nós descrevemos um método para puxar a membrana nanotubos de vesículas lipídicas para estudar a interação de proteínas ou qualquer molécula de curvatura-ativo com membranas curvo em vitro.

Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

Apresentamos uma instalação da pinça óptica acoplada a um microscópio de folha de luz e a sua aplicação a sonda mecânica de células sem grânulos no embrião da drosófila .

Sondando a célula mecânica com pinça óptica de grânulo-livre no embrião da drosófila

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho experimental completo para estudar interações RNA-proteína usando pinças ópticas. Várias possíveis configurações experimentais são delineadas, incluindo a combinação de pinças ópticas com microscopia confocal.

Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar as propriedades mecânicas intracelulares de células isoladas de zebrafish em bidimensionais com medição direta de força por uma armadilha óptica.

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

Aqui, um protocolo integrado baseado em pinças ópticas e microscopia de desfocagem é descrito para medir as propriedades reológicas das células. Este protocolo tem ampla aplicabilidade no estudo das propriedades viscoelásticas de eritrócitos sob condições fisiopatológicas variáveis.

Análise quantitativa das propriedades viscoelásticas das hemácias utilizando pinças ópticas e microscopia desfocagem

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Aprenda a medir a rigidez à flexão de células de E. coli usando armadilhas ópticas. Este método permite investigar as propriedades mecânicas bacterianas e a integridade celular sob estresse mecânico.

Medir a rigidez à flexão de células bacterianas Usando uma armadilha óptica

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