Medir a rigidez à flexão de células bacterianas Usando uma armadilha óptica

Para determinar a rigidez de flexão de células de coli individualmente, primeiro cultive as bactérias até a fase exponencial e, em seguida, anexe-as a uma superfície de lamínula tratada quimicamente. Deixe as células já presas à superfície crescerem ainda mais para que desenvolvam extremidades flexíveis. Em seguida, fluxo em grânulos dielétricos, prenda um cordão e dobre-o na ponta flexível de uma célula.

A etapa final do procedimento é dobrar a célula com a armadilha óptica e medir os dados de deslocamento forçado resultantes. A rigidez à flexão da célula pode ser calculada por um ajuste linear aos dados de deslocamento forçado. Olá, sou Steven Wong, do laboratório do professor Joshua Shere no Instituto Louis Sickler de Genômica Integrativa e do Departamento de Física da Universidade de Princeton.

Hoje vamos mostrar-lhe um procedimento de dobra de células ecológicas individuais e a rigidez celular casada. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar as contribuições de diferentes estruturas intracelulares para a integridade mecânica das células bacterianas. Então vamos começar.

Para iniciar este procedimento, cultive três mililitros de quaisquer células de e coli em LB médio a fase exponencial. Quando as células atingirem uma densidade óptica de 600 nanômetros entre 0,2 e 0,4, suplementar a cultura com 50 microgramas por mililitro de cefalexina por 15 minutos para induzir o crescimento filamentoso. Durante esses 15 minutos, faça uma câmara de fluxo.

Prenda dois pedaços de fita dupla-face com um espaço de três milímetros entre os pedaços em uma lâmina de vidro e cole uma lamínula por cima. O espaço entre os pedaços de fita cria um canal para o fluxo de líquido. Cubra a lamínula com PEI fluindo 10 microlitros de polietilina a 1% diluídos em água para a câmara de fluxo com uma micropipeta incubada por cinco minutos.

Em seguida, lave fluindo 200 microlitros de água em uma extremidade da câmara e coletando na outra extremidade com vácuo. Após 15 minutos de crescimento da bactéria na presença de cefalexina, gire um mililitro de células em uma microcentrífuga e ressuspenda em 200 microlitros de LV com cefalexina. Em seguida, novamente, use uma micropipeta em uma extremidade e aspire na outra extremidade para fluir 50 microlitros da cultura de células concentrada para a câmara que contém a lamínula revestida e incubar por três minutos.

Em seguida, lave com 50 microlitros de Vel B suplementado com cefalexina. Para remover as células soltas, incube a câmara a 37 graus Celsius por 30 minutos a uma hora para permitir que as células anexadas cresçam antes de colocá-las no instrumento de captura óptica enquanto as células estão incubando. Prepare grânulos revestidos de polilisina incubando três microlitros de grânulos de poliestireno de 0,5 micrômetro de diâmetro em um dos 0,1% de polilisina diluídos em água por 30 minutos.

Quando as esferas terminarem de incubar, lave-as três vezes girando em uma microcentrífuga e suspendendo em um mililitro de água, prossiga para ligar as esferas às bactérias e meça a rigidez de ligação das células. O aspecto mais difícil deste protocolo é ser capaz de recrear, localizar e reconhecer uma boa célula para as medições de flexão e rigidez. E uma boa célula é aquela com uma extremidade presa bem definida e um lugar de extremidade livre.

A câmara de fluxo no microscópio procura uma célula com uma extremidade presa bem definida. Algumas células estão presas apenas em uma ponta, e a força de flexão na outra ponta leva a uma célula inteira girando em vez de dobrar. Para encontrar uma célula adequada, dobre cada célula rapidamente com a armadilha usando o movimento de palco controlado por joystick.

Quando uma célula adequada for encontrada, dilua a solução de grânulos por um fator de dois em lb com cefalexina, adicione 30 microlitros da solução de grânulos à câmara de fluxo pipetando em uma extremidade e fluindo suavemente para fora na outra extremidade com um lenço de papel Kim prenda opticamente um grânulo flutuante e toque-o na ponta livre de uma célula. Lave a câmara novamente com micropipeta e usando um tecido branco Kim com 50 microlitros de cefalexina em LB para remover as contas soltas. Em seguida, execute um programa de visualização de laboratório escrito personalizado para aplicar forças de flexão à célula e registrar os dados de deslocamento forçado.

Primeiro, calibre a resposta do detector escaneando RA o cordão anexado dentro do feixe de laser de detecção e registrando os sinais de tensão PSD 3D. Em seguida, identifique o eixo longo da célula em uma imagem de microscópio. Depois de identificar o eixo da célula longa, mova a célula em etapas em uma direção perpendicular ao eixo longo enquanto move o registro da célula, a distância movida e o deslocamento do cordão do centro da armadilha óptica.

Por fim, converta os valores de deslocamento em força aplicada usando a rigidez do trap medida anteriormente e salve. O deslocamento da ponta e a força para arquivar aqui são dados de deslocamento forçado para uma única célula. A inclinação desta linha é a rigidez de flexão da célula.

Acabamos de mostrar como casar a rigidez de flexão da E. coli com uma armadilha óptica. Ao usar este procedimento, é importante lembrar de encontrar uma boa célula com uma extremidade presa e uma extremidade livre bem definidas. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.