Medir a rigidez à flexão de células bacterianas Usando uma armadilha óptica

Para determinar a rigidez à flexão de células individuais de coli, primeiramente, cultive as bactérias até a fase exponencial e, em seguida, fixe-as em uma superfície de lamínula tratada quimicamente. Deixe que as células já aderidas à superfície continuem crescendo, de modo que desenvolvam extremidades flexíveis. Em seguida, introduza microesferas dielétricas, capture uma microesfera e dobre-a até a extremidade flexível de uma célula.

O passo final do procedimento é curvar a célula com o armadilhamento óptico e medir os dados resultantes de deslocamento forçado. A rigidez à flexão da célula pode ser calculada por meio de um ajuste linear aos dados de deslocamento forçado. Olá, sou Steven Wong do Laboratório do Professor Joshua Shere no Instituto Louis Sickler de Genômica Integrativa e no Departamento de Física da Universidade de Princeton.

Hoje vamos mostrar um procedimento para flexionar células bacterianas individuais e medir a rigidez celular. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as contribuições de diferentes estruturas intracelulares para a integridade mecânica das células bacterianas. Então, vamos começar.

Para iniciar este procedimento, cultive três mililitros de células de E. coli em meio LB até a fase exponencial. Quando as células atingirem uma densidade óptica a 600 nanômetros entre 0,2 e 0,4, suplemente a cultura com 50 microgramas por mililitro de cefalexina durante 15 minutos para induzir crescimento filamentoso. Durante esses 15 minutos, monte uma câmara de fluxo.

Fixe dois pedaços de fita adesiva dupla face com um espaço de três milímetros entre eles em uma lâmina de vidro e cole um lamínula por cima. O espaço entre os pedaços de fita cria um canal para o fluxo de líquido. Revesta o lamínula com PEI, introduzindo 10 microlitros de polietileno a 1% diluído em água na câmara de fluxo com uma pipeta microliterada e incube por cinco minutos.

Em seguida, lave passando 200 microlitros de água por uma extremidade da câmara e coletando na outra extremidade com vácuo. Após 15 minutos de crescimento das bactérias na presença de cefalexina, centrifugue um mililitro de células em uma microcentrífuga e reconstitua em 200 microlitros de LV com cefalexina. Em seguida, novamente, use uma micropipeta em uma extremidade e vácuo na outra extremidade para passar 50 microlitros do cultivo celular concentrado para dentro da câmara contendo a lamínula revestida e incube por três minutos.

Em seguida, lave com 50 microlitros de Vel B suplementado com cefalexina. Para remover as células não aderidas, incube a câmara a 37 graus Celsius por 30 minutos a uma hora para permitir que as células aderidas cresçam antes de colocá-las no instrumento de armadilha óptica enquanto as células estão em incubação. Prepare as microesferas revestidas com polilisina incubando três microlitros de microesferas de poliestireno com diâmetro de 0,5 micrômetro em uma solução de polilisina 0,1% diluída em água por 30 minutos.

Quando as incubações das microesferas terminarem, lave-as três vezes centrifugando em uma microcentrífuga e ressuspendendo em um mililitro de água; em seguida, prossiga para ligar as microesferas às bactérias e meça a rigidez de ligação das células. O aspecto mais difícil deste protocolo é conseguir rec, localizar e reconhecer uma boa célula para as medições de flexão e rigidez. E uma boa célula é aquela com uma extremidade presa bem definida e uma extremidade livre.

A câmara de fluxo no microscópio deve ser observada em busca de uma célula com uma extremidade bem definida e fixada. Algumas células estão aderidas apenas em uma das pontas, e a força de flexão na outra ponta leva a uma rotação completa da célula em vez de flexão. Para encontrar uma célula adequada, dobre rapidamente cada célula com a armadilha utilizando o movimento da platina controlado pelo joystick.

Quando uma célula adequada for encontrada, dilua a solução de microesferas por um fator de dois em LB com cefalexina, adicione 30 microlitros da solução de microesferas à câmara de fluxo pipetando em uma extremidade e fluindo suavemente pela outra extremidade com um lenço Kimwipe; capture opticamente uma microesfera flutuante e toque-a na extremidade livre de uma célula. Lave novamente a câmara com micropipeta e utilizando um lenço Kimwipe com 50 microlitros de cefalexina em LB para remover microesferas não ligadas. Em seguida, execute um programa personalizado em LabVIEW para aplicar forças de flexão à célula e registrar os dados de deslocamento forçado.

Primeiro, calibre a resposta do detector realizando uma varredura RA na esfera acoplada dentro do feixe a laser de detecção e registrando os sinais de tensão do PSD 3D. Em seguida, identifique o eixo longo da célula em uma imagem de microscópio. Após identificar o eixo longo da célula, mova a célula em etapas numa direção perpendicular ao eixo longo, ao mesmo tempo em que registra a distância percorrida e o deslocamento da esfera a partir do centro do armadilhamento óptico.

Por fim, converta os valores de deslocamento em força aplicada utilizando a rigidez da armadilha previamente medida e salve. O deslocamento da ponta e a força registrados neste arquivo são dados de deslocamento forçado para uma única célula. A inclinação desta reta representa a rigidez à flexão da célula.

Acabamos de mostrar como associar a rigidez à flexão de E. coli a um armadilho óptico. Ao utilizar este procedimento, é importante lembrar-se de encontrar uma boa célula com uma extremidade presa bem definida e uma extremidade livre. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.