Remoção mecânica de córion e membrana vitelina: um método para preparar oócitos de Drosophila para observação direta

- Comece com oócitos maduros de ovários fixos em uma solução salina. Os oócitos maduros apresentam cascas de ovo que consistem em um córion externo e uma membrana vitelina interna.

Para remover mecanicamente o córion e a membrana vitelina, coloque os oócitos entre as partes foscas de duas lâminas pré-tratadas. Mova o slide superior em movimentos retos para frente e para trás para criar atrito que rola os oócitos.

Agora, mova a corrediça superior em um pequeno ângulo para rolar os oócitos em outra direção. Evitando o movimento circular, aumente esse ângulo em incrementos curtos até que o slide superior se mova perpendicularmente ao slide inferior. Esse movimento remove mecanicamente os córions e as membranas vitelinas, permitindo o acesso de sondas ou manchas ao oócito.

Os oócitos sem córions parecerão longos e finos, e aqueles sem membranas vitelinas terão pontas pontiagudas. Para separar os oócitos limpos dos detritos circundantes, transfira a mistura de amostras para um tubo e permita que os oócitos se assentem no fundo enquanto os detritos flutuam no topo e podem ser removidos.

Neste protocolo, removeremos as membranas córion e vitelina de oócitos maduros de Drosophila.

- Para separar os oócitos em estágio avançado, primeiro adicione 1 mililitro de PBSBTx a uma placa de dissecação rasa. Em seguida, use um P200 com uma ponta revestida com BSA para transferir ovários fixos para o prato raso. Pipete os ovários para cima e para baixo com a ponta da pipeta revestida com BSA para desalojar os oócitos maduros dos oócitos menos maduros.

Quando os oócitos em estágio avançado estiverem suficientemente separados, transfira todo o tecido para um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Remova o excesso de líquido com uma pipeta Pasteur puxada, deixando cerca de 150 a 200 microlitros no tubo.

Para se preparar para o enrolamento do oócito, pré-umedeça um prato de poço fundo com 200 microlitros de PBSBTx. Cubra o prato e reserve.

Obtenha três lâminas de vidro fosco e coloque a lâmina três de lado. Em seguida, esfregue suavemente as regiões de vidro fosco das lâminas um e dois. Enxágue-os em água deionizada para remover quaisquer cacos de vidro e seque com um lenço descartável. Cubra as regiões foscas das lâminas um e dois com PBSBTx adicionando 50 microlitros de PBSBTx a uma lâmina e esfregando esta região com a outra lâmina. Remova o líquido com um lenço descartável e coloque as lâminas sob um microscópio de dissecação. Mantenha as regiões foscas das lâminas um e dois em contato com a lâmina três que suporta a lâmina dois.

Para rolar os oócitos, primeiro, umedeça previamente uma ponta de pipeta P200 em PBSBTx e disperse os oócitos no tubo de microcentrífuga pipetando para cima e para baixo. Transfira 50 microlitros de líquido contendo os oócitos para o centro da parte de vidro fosco da lâmina um. Levante o slide dois para fazer isso.

Abaixe lentamente o slide dois até que a tensão superficial do líquido crie uma vedação entre as duas regiões de vidro fosco. Deve haver líquido suficiente para cobrir a área fosca, mas nenhum deve vazar. Em seguida, segure o slide inferior um no lugar com uma mão e use a outra mão para mover o slide superior dois para frente e para trás na direção horizontal, mantendo o slide dois nivelado e apoiado no slide três.

Execute sob um microscópio para facilitar a visualização dos movimentos e progresso dos oócitos. Depois de alguns movimentos na direção horizontal, mude ligeiramente o ângulo de movimento. Em vários incrementos, aumente gradualmente esse ângulo para 90 graus até que o movimento do slide superior dois seja perpendicular à direção inicial. Observe que os córions vazios serão visíveis no líquido e os oócitos sem córions parecerão mais longos e mais finos.

- Ao rolar os oócitos, certifique-se de que a direção do rolamento seja sempre em linha reta e nunca em movimento circular.

- Repita o rolamento cerca de 7 a 10 vezes até que a solução fique ligeiramente turva. Pare de rolar quando a maioria dos oócitos parecer ter perdido suas membranas vitelinas.

Levante suavemente a lâmina superior dois, arrastando um de seus cantos para o centro da região fosca na lâmina inferior um para que os oócitos enrolados se acumulem no centro da região fosca. Lave os oócitos de ambas as lâminas com PBSBTx na placa de poço profundo contendo PBSBTx.

Limpe as lâminas um e dois com água ultrapura. Seque com um lenço descartável e reinicie. Repita essas etapas até que todos os oócitos do mesmo genótipo tenham sido enrolados. Isso geralmente requer três a quatro rodadas de rolagem por genótipo.

Para remover detritos após o rolamento, adicione 1 mililitro PBSBTx a um tubo cônico de 15 mililitros. Agite o líquido para revestir as laterais do tubo. Usando uma ponta de pipeta P1000 revestida com PBSBTx, transfira os oócitos enrolados da placa de poço profundo para o tubo cônico contendo 1 mililitro de PBSBTx. Adicione mais 2 mililitros de PBSBTx ao tubo cônico que contém os oócitos.

Segure o tubo cônico contra um fundo escuro para ver os oócitos opacos enquanto eles afundam. Depois de deixar os oócitos assentarem no fundo, use um P1000 para remover os 2 mililitros superiores da solução contendo detritos e descarte.

Depois de repetir a etapa para um total de três rodadas de remoção de detritos, use uma ponta de pipeta P1000 revestida com PBSBTx para transferir os oócitos de volta para o tubo de microcentrífuga original de 500 microlitros. 20 a 25 fêmeas devem produzir aproximadamente 50 microlitros de oócitos maduros enrolados.