Enkelt celle dissociation af Caenorhabditis elegans:En metode til at isolere levende celler

- Start med vaskede pelleterede orme og tilsæt lysis buffer indeholdende SDS, et vaskemiddel, og DDT, et reducerende middel. Dette nedbryder ormens beskyttende kutikula udsætter kroppen for celle dissociation. Undgå langvarig udsættelse for lysis buffer for at minimere celle lysis og død.

Fjern derefter lysisreagenserne med flere vaske af kold isolationsbuffer. Det er vigtigt, at denne buffer er af den korrekte osmolaritet for at forhindre celledød. Brug et proteaseenzym til at nedbryde celle til celleforbindelser. Hjælp homogeniseringsprocessen sammen med mekanisk energi ved at pipettere blandingen mod rørvæggen.

Tilsæt medier, der indeholder serum, for at stoppe enzymreaktionen og antibiotika for at forhindre kontaminering. Pellet og vask prøven flere gange for at fjerne det meste af snavset.

Endelig skal røret anbringes på is for at tage hensyn til tyngdekraften sedimentering.

I eksempelprotokollen vil vi adskille transgene orme, der udtrykker GFP i neuroner af interesse for at isolere og analysere disse celler.

- Efter opsamling af dyrene centrifuges de ved 1.600 gange g i fem minutter. Fjern alle supernatanterne, og ophæng ormene igen i 1 milliliter M9-medier.

Centrifuge ved 1.600 gange g i fem minutter for at pellet ormene. Derefter tilsættes 200 mikroliter af SDS-DDT buffer og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Ormene skal nu synes at være rynket langs kroppen, hvis de ses under et let mikroskop.

Dernæst tilsættes 800 mikroliter iskold isolationsbuffer og blandes ved forsigtigt at svirpe røret. Centrifuge ved 13.000 gange g og ved 4 grader Celsius i et minut for at pellet ormene. Fjern supernatanten og vask med 1 milliliter isolationsbuffer.

Gentag denne centrifugerings- og vaskeproces i alt fem gange, og sørg for forsigtigt at fjerne isolationsbufferen hver gang. Derefter tilsættes 100 mikroliter proteaseblanding fra Streptomyces griseus opløst i isolationsbuffer til pellet.

Inkuber ved stuetemperatur i 10 til 15 minutter. Sørg for at anvende mekanisk forstyrrelse ved at pipettere op og ned 60 til 70 gange med 200 mikroliter mikropipettespidsen mod bunden af røret. For at bestemme fordøjelsesstadiet skal du fjerne 1 til 5 mikroliter af fordøjelsesblandingen, slippe den på en glasrutsjebane og inspicere den ved hjælp af et vævskulturmikroskop.

Efter fem til syv minutter, orm fragmenter bør have en synligt reduceret kutikula og en gylle af celler vil være let synlige. Stop reaktionen ved at tilføje 900 mikroliter af kommercielt tilgængelige Leibovitz's L15 medium suppleret med 10% FBS og penicillin-streptomycin.

Centrifuge ved 10.000 gange g og ved 4 grader Celsius i 5 minutter til pellet isolerede fragmenter og celler. Vask pelleted cellerne to gange mere med kolde L15 suppleret medier ved hjælp af 1 milliliter medier pr vask. Re-suspendere pelleted celler i 1 milliliter af L15 suppleret medier og lad på is i 30 minutter.

Tag derefter det øverste lag, som er ca. 700 til 800 mikroliter, og overfør det til et mikrocentrifugerør. Brug en automatiseret celletæller eller hæmocytometer til at måle celletætheden på 10 til 25 mikroliter af isolerede celler.