Dissociação de célula única de Caenorhabditis elegans: um método para isolar células vivas

- Comece com vermes peletizados lavados e adicione tampão de lise contendo SDS, um detergente, e DTT, um agente redutor. Isso quebra a cutícula protetora do verme, expondo o corpo à dissociação celular. Evite a exposição prolongada ao tampão de lise para minimizar a lise e a morte celular.

Em seguida, remova os reagentes de lise com várias lavagens de tampão de isolamento a frio. É importante que esse tampão tenha a osmolaridade correta para evitar a morte celular. Use uma enzima protease para quebrar as conexões célula a célula. Ajude o processo de homogeneização junto com a energia mecânica, pipetando a mistura contra a parede do tubo.

Adicione meios contendo soro para interromper a reação enzimática e antibióticos para evitar contaminação. Pellet e lave a amostra várias vezes para remover a maioria dos detritos.

Finalmente, coloque o tubo no gelo para permitir a sedimentação por gravidade. Os detritos, incluindo restos da cutícula ou aglomerados de células, se depositam, enquanto as células dissociadas permanecem suspensas na camada superior do meio. Essas células podem ser usadas para cultura de curto prazo ou para isolar populações de células específicas por FACS ou imunoprecipitação.

No protocolo de exemplo, dissociaremos vermes transgênicos que expressam GFP em neurônios de interesse para isolar e analisar essas células.

- Depois de coletar os animais, centrifugue-os a 1.600 vezes g por cinco minutos. Remova todo o sobrenadante e ressuspenda os vermes em 1 mililitro de meio M9. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Centrifugue a 1.600 vezes g por cinco minutos para peletar as minhocas. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão SDS-DDT e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Os vermes agora devem parecer enrugados ao longo do corpo se vistos sob um microscópio de luz.

Em seguida, adicione 800 microlitros de tampão de isolamento gelado e misture agitando suavemente o tubo. Centrifugue a 13.000 vezes g e a 4 graus Celsius por um minuto para peletizar os vermes. Remova o sobrenadante e lave com 1 mililitro de tampão de isolamento.

Repita este processo de centrifugação e lavagem um total de cinco vezes, certificando-se de remover cuidadosamente o tampão de isolamento a cada vez. Depois disso, adicione 100 microlitros de mistura de protease de Streptomyces griseus dissolvida em tampão de isolamento, ao pellet.

Incube em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Certifique-se de aplicar a interrupção mecânica pipetando para cima e para baixo 60 a 70 vezes com a ponta da micropipeta de 200 microlitros contra o fundo do tubo. Para determinar o estágio da digestão, remova de 1 a 5 microlitros da mistura de digestão, coloque-a em uma lâmina de vidro e inspecione-a usando um microscópio de cultura de tecidos.

Após cinco a sete minutos, os fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e uma pasta de células será facilmente visível. Interrompa a reação adicionando 900 microlitros de meio L15 de Leibovitz disponível comercialmente suplementado com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina.

Centrifugue a 10.000 vezes g e a 4 graus Celsius por 5 minutos para granular fragmentos e células isoladas. Lave as células peletizadas mais duas vezes com meio suplementado L15 frio usando 1 mililitro de meio por lavagem. Ressuspenda as células peletizadas em 1 mililitro de meio suplementado com L15 e deixe no gelo por 30 minutos.

Em seguida, pegue a camada superior, que é de aproximadamente 700 a 800 microlitros, e transfira-a para um tubo de microcentrífuga. Use um contador de células automatizado ou hemocitômetro para medir a densidade celular de 10 a 25 microlitros de células isoladas.