Name: Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda um procedimento de metabolômica em uma etapa para análise de carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos por GC/MS. Este método melhora o rastreamento neonatal, detectando 38% de distúrbios genéticos adicionais não identificados por espectrometria de massa em tandem.

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A assistência técnica capaz de Anthony Thomas é reconhecido agradecimento.

Procedimento para Processamento de Amostras de Urina <ol><li> Descongelar a amostra de urina em um banho de água 37 ° C. Decantar em um recipiente novo se o original é comprometida. </li><li> Dê uma alíquota máxima de 13 ml de amostra e armazená-lo a -20 ° C em um tubo de centrífuga cônico rotulados. </li><li> Medir e registrar a densidade óptica da amostra, colocando algumas gotas de urina no refratômetro. </li><li> Filtrar a amostra através de um filtro de 0,2 um. </li><li> Meça o volume da amostra abaixo de acordo com a densidade óptica <table border="0"><tbody><tr><td> 1,000-1,009 </td><td> 1,00 ml </td></tr><tr><td> 1,010-1,019 </td><td> 0,50 ml </td></tr><tr><td> 1,020-1,050 </td><td> 0,25 ml + 0,25 ml H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> O volume especificado é então transferido para uma Reactivial contendo as seguintes normas internas: 500 nanomoles (nmoles) 3 Creatina, 10 nmoles d ácido 3 Methylmalonic, 100 nmoles cada um dos 13 seguintes lactato C 3, 13 C 3 piruvato, 13 C 2 15 N glicina, serina d 3, d 5 fenilalanina, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, d ácido 4 sebácico, 13 C 6 glicose, inositol e d 6 d 5 triptofano. </li><li> 20 microlitros (L) de um 7,5 Unidades / mL de solução de urease (Calzyme catálogo Laboratories não. 116A0100) é adicionado à amostra, que é então lavada e selado sob CO 2 através de um septo inerte. </li><li> A amostra é realizada a 37 ° C por 30 minutos com mais gás de dióxido de carbono acrescentado em intervalos de 15 minutos para manter a pressão. </li><li> 20 l da solução mais urease é adicionado, o frasco é lavada com dióxido de carbono, sendo a amostra mantida a 37 ° C por mais 15 minutos. </li><li> 500 mL de acetona 30:70: metanol é adicionado, o septo de borracha é substituído por um septo de teflon revestida, ea amostra é refrigerada a -20 ° C por 15 minutos. </li><li> Sólidos são removidos por centrifugação a 1500 rpm x 10 minutos e decantado em um ambiente limpo 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) </li><li> Adicionar trifluoroacetato triethylammonium (TEA / TFA) (Sigma) como segue: <ul><li> 20 l para 1,00 ml amostras </li><li> 40 mL para 0,5 ml, ou menos, as amostras </li></ul></li><li> Blusa com acetonitrila e colocar sob um fluxo de nitrogênio a 70 ° C, até volume constante é alcançada (TEA / TFA permanecerá) (~ 15 minutos). </li><li> Repita o passo 13, até 4 vezes até que se forme um precipitado (~ 10 minutos cada). </li><li> Deixe esfriar por cerca de 2 minutos. Blusa com cloreto de metileno, tendo o cuidado de ferver, e seca (~ 4:00 minutos). </li><li> Repita o passo 15. </li><li> Adicionar MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Thermal Científica) às seguintes taxas: <ul><li> 150 mL para 1,00 ml amostras </li><li> 200 mL para 0,50 ml, ou menos, as amostras </li></ul></li><li> Cap sob atmosfera de nitrogênio e incubar a 70 ° C por 1 hora. </li><li> Transferência para microtubos, sob uma atmosfera de nitrogênio, para análise em cromatógrafo a gás espectrômetro / massa. </li><li> Microtubos lugar para injeção automatizada pela Agilent 5975 GC / MS: Instrumento temperaturas são as seguintes: injetor 200 ° C, interface 250 ° C, forno 80 ° C por 1 minuto; rampa a 4 ° C / minuto 80-130 ° C rampa, em 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa a 12 ° C / minuto 200-285 ° C, segure por 10 minutos. Coluna: 25 m, 320 micron ID, 0,5 micron de espessura de filme DB-5. Spec massa: fonte de 230 ° C, quad 150 ° C, Scan 50-650 amu em 2,46 scans / sec. Solvente demora 3,5 minutos. </li></ol> Resultados representante Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">clique aqui</a> para ver os resultados representativos.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

O Laboratório de Triagem metabólica é um laboratório CLIA-clínico licenciado de propriedade da Saint Louis University, uma corporação sem fins lucrativos. Dr. Shoemaker não diretamente o lucro das receitas de laboratório, mas podem se beneficiar indiretamente a produtividade do laboratório. Nenhum dos métodos, técnicas, resultados, valores normais, macros, software bibliotecas ou conclusões são considerados proprietários e estão disponíveis gratuitamente para os interessados.

O método urease (1) tem sido citado 62 vezes na literatura médica, com várias modificações. Grupo Matsumoto (2,3) simplificou o procedimento para high-throughput screening neonatal e relatou os resultados de 16.000 pacientes. Kuhara e outros (4-7) relataram o uso do método em vários casos de diagnóstico de erro inato e follow-up. Rhead (8) também confirmou a utilidade do método para o diagnóstico clínico e acompanhamento de erros inatos. O método tem sido aplicado a urina de ursos, camundongos knock-out, elefantes e homogeneizados de moscas da fruta inteira e suas larvas (9). Meios de cultura de Cryptococcus antes e depois do local dirigida mutagênese também foram analisados, sem a etapa urease (10). O método foi aplicado para avaliação nutricional em estudantes de medicina humana, de Down e pacientes com síndrome demencial veteranos idosos depois de carregar os indivíduos com doses orais dos aminoácidos triptofano, metionina e isoleucina (11). Todos os oito vitaminas B foram avaliados pela quantificação do produtos de degradação dos três aminoácidos que, entre eles, exigir que todas as oito vitaminas em algum momento de sua degradação. Os efeitos tóxicos de produtos farmacêuticos e sua mitigação pela suplementação de vitamina tem sido relatada (12). Amostras de líquido amniótico de gestações normais e síndrome de Down foram analisados ​​e relatados (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computador</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computador</td></tr><tr><td>Urease</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Também Sigma C3</td></tr><tr><td>Padrões de Isótopos Estáveis</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solventes</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analitos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colunas CG</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Frascos</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Cada criança nascida em os EUA estão agora selecionados para até 42 distúrbios genéticos raros chamado de &quot;erros inatos do metabolismo&quot;. O método de rastreamento é baseado em espectrometria de massa e quantifica acilcarnitinas como uma tela de acidemias orgânicas e também medidas de aminoácidos. Todos os estados também realizam testes enzimáticos para distúrbios de carboidratos, como galactosemia. Porque os resultados podem ser não-específicos, testes de acompanhamento de resultados positivos é necessário usar um método mais definitivo. O presente relatório descreve o &quot;urease&quot; método de preparação de amostras para triagem de erros inatos. Enzima urease cristalino é usado para remover a uréia a partir de fluidos corporais que permite a maioria dos outros metabólitos solúveis em água para ser desidratado e derivatizado por cromatografia gasosa em um único procedimento. Desidratação por evaporação em um fluxo de nitrogênio é facilitada pela adição de acetonitrila e cloreto de metileno. Então, trimethylsilylation ocorre na presença de um único trifluoroacetato triethylammonium catalisador,. Injeção automatizada e cromatografia é seguido por macro-driven quantificação custom de 192 metabolitos e semi-quantificação de cada componente principal utilizando bibliotecas especializadas de espectros de massa de TMS derivatizado compostos biológicos. A análise pode ser realizada na plataforma ChemStation amplamente utilizado usando as macros e bibliotecas disponíveis do autor. Em nosso laboratório, mais de 16.000 amostras de pacientes foram analisados ​​usando o método com um rendimento diagnóstico de cerca de 17% - ou seja, 17% dos resultados de amostras revelam descobertas que devem ser postas em prática pelo médico de ordenação. Entre estes, estão confirmadas mais de 180 erros inatos, dos quais cerca de 38% não poderia ter sido diagnosticada por meio de métodos anteriores.

O método da urease de preparação de amostra para análise GC / MS de metabólitos intermediários é apresentado por seu inventor. O método permite uma etapa de acompanhamento da triagem neonatal para erros inatos por espectrometria de massa em tandem por carboidratos quantificar, orgânicos e aminoácidos tudo em um único processo.

Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único

Cada recém-nascido nos EUA é agora submetido a uma triagem para até 42 distúrbios genéticos raros denominados "erros inatos do metabolismo". O método de triagem baseia-se em...

Neste procedimento único de metabolômica, amostras biológicas são preparadas para análise de carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos por espectrometria de massas com cromatografia gasosa em um único procedimento. As amostras são primeiramente tratadas com a enzima urease para remoção da ureia. O segundo passo do procedimento consiste em desidratar as amostras na presença de um detergente composto por dois componentes voláteis, triationa, amônio e acetato de trifluoro.Em seguida, realiza-se a derivatização dos componentes por trimetilação. E, finalmente, a análise por cromatografia gasosa, espectrometria de massas em árvore, quantificação automatizada de carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos, isol, glicina e açúcares amino permite a confirmação e o acompanhamento da maioria dos distúrbios genéticos detectados no rastreamento neonatal e de 38% adicionais de distúrbios não rastreados atualmente pela espectrometria de massas em tandem. Olá, sou Jim Shoemaker do Laboratório de Rastreamento Metabólico da Universidade de St. Louis.Estou aqui para demonstrar a metabolômica em um único passo, um método para analisar fluidos biológicos em busca de metabólitos intermediários sem separar compostos ácidos, básicos e neutros. Isso torna possível complementar a triagem neonatal por espectrometria de massas em tandem com um único procedimento que permite analisar ácidos orgânicos, aminoácidos, carboidratos, derivados de carboidratos e glicina ACell, tudo em uma única etapa. O resultado é que, no gráfico atrás de mim, você pode observar que os diagnósticos em vermelho podem ser realizados mediante a metabolômica em um único passo, mas não teriam sido detectados pela triagem neonatal atual por espectrometria de massas em tandem.Então vamos começar a demonstração. Para iniciar este procedimento, aqueça a amostra de urina em banho-maria a 37 graus Celsius. Se o recipiente original estiver comprometido, transfira uma amostra para um novo recipiente.Retire uma alíquota da amostra e armazene-a a menos 20 graus Celsius em um tubo cônico de centrífuga rotulado como cópia de segurança. Em seguida, meça e registre a densidade óptica da amostra colocando algumas gotas de urina no refratômetro portátil. Após a medição da densidade óptica, filtre a amostra através de um filtro de 0,2 mícron.Meça o volume da amostra de acordo com a densidade óptica medida anteriormente à filtração. Para valores entre um e 1,009, utilize um mililitro da amostra; para valores entre 1,01 e 1,019, utilize 0,5 mililitro da amostra; e para valores entre 1,02 e 1,05, combine 0,25 mililitro da amostra com 0,25 mililitro de água.Transfira o volume especificado para um vial reativo já contendo os padrões internos marcados com isótopos indicados na tabela mostrada aqui. Os padrões incluem creatina, ácido metilmalônico, lactato, piruvato, glicina, sine fenilalanina, hexa óleo, glicina, orato, ácido SEBA, glicose, inositol e triptofano. Em seguida, adicione 20 microlitros de uma solução de urease a 7,5 unidades por microlitro.Enxágue a amostra e feche sob dióxido de carbono por meio de uma septa inerte. Mantenha a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos, adicionando mais gás dióxido de carbono em intervalos de 15 minutos para manter a pressão, ao final da incubação de 30 minutos, com 20 microlitros adicionais da solução de urease. Enxágue o frasco com dióxido de carbono e mantenha a amostra a 37 graus Celsius por mais 15 minutos.Após a conclusão do tratamento com urease, prossiga imediatamente para desidratar e derivatizar a amostra logo após o tratamento com urease. Adicione 500 microlitros de uma solução de acetona a metanol na proporção de 30 a 70. Para as amostras, substitua o septo de borracha por um septo revestido com teflon.Resfrie a amostra a menos 20 graus Celsius por 15 minutos. Remova os sólidos por centrifugação a 1500 RPM por 10 minutos e, em seguida, transfira o sobrenadante para um frasco reagente limpo de 2,0 mL. Adicione agora triamônio, trifluoroacetato ou T-E-A-T-F-A, que é o catalisador para trimetilação: 20 microlitros para amostras de um mililitro e 40 microlitros para amostras de 0,5 mililitro ou menos.Complete com acetonitrila e coloque sob fluxo de nitrogênio a 70 graus Celsius até que o volume constante seja alcançado, indicando que apenas o T-E-A-T-F-A permanece. Isso leva cerca de 15 minutos. Novamente, complete com acetonitrila e coloque sob fluxo de nitrogênio a 70 graus Celsius até que um volume constante seja alcançado, repetindo até quatro vezes até que um precipitado se forme.Isso leva cerca de 10 minutos cada vez após a desidratação; deixe esfriar por cerca de dois minutos. Complete com cloreto de metileno, tomando cuidado com a fervura excessiva, e seque. Isso leva cerca de quatro minutos.Complete com cloreto de metileno e seque. Mais uma vez. Em seguida, realize a derivatização da amostra.Adicione 150 microlitros de OFM, STFA para amostras de um mililitro e 200 microlitros por 0,5 mililitro ou menos. Tampe as amostras sob atmosfera de nitrogênio e incube a 70 graus Celsius por uma hora. Ao final da incubação de uma hora, trabalhe sob atmosfera de nitrogênio para transferir as amostras para vial micro para análise em um espectrômetro de massas acoplado a cromatógrafo gasoso; o Agilent 5 9 7 5 GCMS é utilizado aqui com uma coluna capilar DB cinco.Para a espectrometria de massas, defina a fonte em 230 graus Celsius, o quadrupolo em 150 graus Celsius e a faixa de varredura de massa em 50 a 650 A MU a 2,46 varreduras por segundo. O atraso do solvente é de 3,5 minutos. As temperaturas do instrumento são de 200 graus Celsius para o injetor e 250 graus Celsius.Para a interface, ajuste o forno a 80 graus Celsius por um minuto, depois aumente a temperatura a uma taxa de quatro graus Celsius por minuto de 80 a 130 graus Celsius, em seguida aumente a uma taxa de seis graus Celsius por minuto de 130 a 200 graus Celsius, e finalmente aumente a uma taxa de 12 graus Celsius por minuto de 200 a 285 graus Celsius e mantenha por 10 minutos. Coloque os microfrascos contendo as amostras derivadas para injeção automatizada pelo GCMS e inicie a análise. Um espectro representativo de uma amostra de urina analisada por GCMS após tratamento com urease é mostrado aqui, com os picos correspondentes aos metabólitos ácido piroglutâmico, ácido 4-hidróxi-cicloacético e hawkinson assinalados.Esses metabólitos são indicativos de Anúria de Hawkins, um distúrbio genético raro. Todos os picos no espectro podem ser atribuídos a metabólitos conhecidos e quantificados. Os resultados dos testes iniciais de triagem neonatal podem ser inespecíficos.No entanto, os níveis elevados de metabólitos da UR de Hawkins na amostra de urina analisada por GCMS, conforme mostrado aqui, confirmaram o diagnóstico desta doença do erro inato do metabolismo. Utilizando o mesmo método de URIs, erros inatos foram diagnosticados em 184 pacientes. Cerca de 40% dos diagnósticos mostrados em vermelho não teriam sido feitos pela espectrometria de massas em tandem comumente usada no rastreamento neonatal.Assim, essa é a nossa demonstração de como realizar metabolômica em um único passo utilizando o método da urease para analisar fluidos biológicos quanto a carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos, e acil glicina, tudo no mesmo procedimento. É importante lembrar que, ao avaliar a eficácia do procedimento, a digestão com urease, a desidratação e a simulação de trimetilação podem todas ser avaliadas quanto à sua completude, bastando verificar a presença de todos os padrões internos.Os padrões internos foram escolhidos deliberadamente para demonstrar, por exemplo, que a desidratação foi completa, pois, caso contrário, a creatinina TRI TMS não estaria presente na quantidade total. Essa é a nossa demonstração. Se você tiver interesse nos macros e bibliotecas que desenvolvemos para interpretar este procedimento usando o ChemStation, envie-me um e-mail no endereço exibido na tela, e mais informações sobre o nosso laboratório podem ser encontradas no URL mostrado na tela.Muito obrigado. Aqui é Jim Shoemaker.

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A finalidade deste artigo é descrever um protocolo para a extração de Metabolites aquoso das pilhas aderentes cultivadas para a análise Metabolômica, particular, a electroforese capilar-espectrometria maciça.

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Construímos um fluxo de trabalho metabolômico não-acompanhado que integrou XY-Meta e metaX juntos. Neste protocolo, exibimos como usar o XY-Meta para gerar uma biblioteca espectral chamariz a partir da referência de espectro de acesso aberto e, em seguida, executamos o controle FDR e usamos o metaX para quantificar os metabólitos depois de identificar o espectro metabolômico.

Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR

Este protocolo visa preservar metabólitos celulares para espectrometria de massa de célula única (SCMS), combinando lavagem de solução salina volátil, têmpera rápida de nitrogênio líquido, liofilização e armazenamento de -8 °C. Isso demonstra que a extinção do nitrogênio líquido é essencial para manter os perfis de metabólitos, enquanto o armazenamento refrigerado prolongado deve ser minimizado para evitar alterações metabólicas.

Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

Aprenda um procedimento de metabolômica em uma etapa para análise de carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos por GC/MS. Este método melhora o rastreamento neonatal, detectando 38% de distúrbios genéticos adicionais não identificados por espectrometria de massa em tandem.

Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único

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