Triagem de toxicidade química baseada em embriões: avaliando os efeitos no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

- Comece adicionando 5 embriões em meio E3 a cada poço de uma placa de 96 poços e remova o excesso de meio com uma pipeta. Adicione o meio E3 contendo canamicina em cada poço para evitar contaminação. Deixe os embriões crescerem a 28 graus Celsius.

Dilua o composto de interesse com um solvente apropriado, como DMSO, para preparar várias concentrações ou doses e teste o efeito de cada dose em embriões em desenvolvimento. Quando os embriões atingirem o estágio desejado, pipetar cada solução estoque em poços individuais. Cubra o prato com uma tampa e agite-o suavemente para misturar o conteúdo. Deixe os embriões na placa do poço crescerem a 28 graus Celsius.

No momento desejado do desenvolvimento embrionário, coloque a placa do poço sob um microscópio adequado para examinar o fenótipo dos embriões. Você pode observar fenótipos como perda de olhos, atraso no crescimento ou perda de melanócitos nos embriões em desenvolvimento. No protocolo a seguir, testaremos uma biblioteca de compostos para inibidores de pequenas moléculas do desenvolvimento do prosencéfalo.

- Bibliotecas de moléculas pequenas são normalmente fornecidas em uma placa de origem de 96 poços com cada composto armazenado em DMSO como um estoque de 10 milimolares. Cerca de 60 minutos antes de os embriões atingirem o estágio desejado, descongele um número apropriado de placas de 96 poços contendo alíquotas de pequenas moléculas. Anote o número de série ou outro número de identificação das placas de origem. Para minimizar a condensação nas placas, descongele em uma câmara de dessecação contendo drierita.

Gire brevemente as placas em uma centrífuga de mesa equipada com um adaptador de placa de vários poços. Remova a fita de vedação de alumínio da placa de origem. Usando uma pipeta de 12 canais, dilua os compostos na placa de origem até a concentração desejada com DMSO. Neste protocolo, usamos uma concentração final de 0,5 milimolar e adicionamos 4,75 microlitros de DMSO para diluir a placa de estoque de 10 milimolares.

Quando os embriões na placa de 96 poços atingirem o estágio desejado, use uma pipeta de 12 canais para transferir 2,5 microlitros de compostos das placas de origem para as placas receptoras contendo os embriões. Cubra as placas que agora contêm os embriões e compostos com tampas e registre o número de identificação das placas de origem nas placas de embriões. Misture as placas girando suavemente e coloque-as em uma incubadora de 28,5 graus Celsius. Cubra cada placa de origem contendo pequenas moléculas não utilizadas com fita de vedação de alumínio e coloque em um freezer de 80 graus Celsius negativos para armazenamento de longo prazo.

Antes de executar a tela visual, formule um critério de ocorrência específico. Por exemplo, em uma triagem para inibidores de pequenas moléculas do desenvolvimento do prosencéfalo, um acerto pode ser um composto que confere a perda do prosencéfalo. A ausência de olhos é um indicador visual fácil da perda do prosencéfalo e não requer fluorescência para analisar.

Nos momentos desejados do desenvolvimento, remova as placas de 96 poços contendo embriões tratados com compostos da incubadora e examine cada poço sob um microscópio estereoscópico. Ao rastrear inibidores de pequenas moléculas do desenvolvimento do prosencéfalo, examine as placas em 28 horas quanto à perda do olho como um marcador de inibição do desenvolvimento do prosencéfalo. Registre a identidade da placa e a localização do poço para qualquer poço em que pelo menos 3 em cada 5 embriões exibam o fenótipo de acerto prescrito.

Coloque a placa de 96 poços de volta na incubadora. Reconfirme a perda de olhos e prosencéfalo em 48 horas. Mesmo que os embriões não tenham prosencéfalo, eles sobreviverão por pelo menos quatro dias. Reconfirme um possível acerto testando novamente os efeitos do composto em várias doses. Para cada dose, 10 embriões são testados em 0,5 mililitros de meio E3 em formato de placa de 48 poços.

O momento da adição do composto para o novo ensaio deve ser idêntico ao do rastreio original. Um acerto é confirmado quando o fenótipo induzido é reproduzido de maneira dependente da dose no novo teste do composto. Finalmente, identifique o composto atingido no banco de dados de pequenas moléculas na biblioteca química.