0 visualizações • 3:39 min. • April 30th, 2023
- Dissolva o metronidazol em água de ovo contendo DMSO, um solvente, e adicione feniltioureia, que evita a formação de pigmentos nos embriões. Transfira algumas larvas da idade apropriada para placas de tratamento e controle. Em seguida, adicione a concentração desejada da solução de metronidazol à placa de teste e água de ovo contendo DMSO à placa de controle.
Deixe as larvas em ambas as placas crescerem a 28 graus Celsius. As larvas transgênicas produzem nitroredutase apenas nos hepatócitos, que converte o metronidazol em uma droga citotóxica, resultando na morte apenas dos hepatócitos alvo. Após o tratamento, remova a solução de metronidazol da placa de tratamento e lave os embriões com água de ovo.
Adicione tricaína para anestesiar as larvas e examine-as em um microscópio de epifluorescência para ablação grave de hepatócitos - a destruição das células do fígado. Você observará um fígado muito menor em indivíduos tratados do que em indivíduos do grupo controle. No protocolo de exemplo, usaremos metronidazol para ablação de hepatócitos em larvas de peixe-zebra transgênicas para estudar a regeneração hepática.
- Transfira até 100 embriões para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 25 mililitros de água de ovo e coloque a placa a 28 graus Celsius. Para inibir a pigmentação, adicione PTU à cultura até 10 horas após a fertilização. Às 80 horas após a fertilização, anestesiar as larvas com tricaína e usar um microscópio de epifluorescência para coletar as larvas positivas para CFP, mantendo apenas os animais com fígados de tamanho semelhante
Em seguida, substitua a água do ovo de tricaína por água fresca suplementada com PTU e retorne as larvas de peixe-zebra positivas para CFP à incubadora de 28 graus Celsius. Para tratar as larvas de peixe-zebra com MTZ, primeiro divida o número apropriado de larvas em dois recipientes de cultura diferentes. Manter o grupo de larvas experimentais numa solução de MTZ acabado de preparar e o grupo de controlo em água de ovo suplementada com DMSO.
Cubra o grupo experimental com papel alumínio para evitar a fotoinativação da MTZ e incube os dois grupos de larvas de peixe-zebra a 28 graus Celsius. No final do período de ablação, remova a solução MTZ das placas e lave a lava tratada com MTZ duas a três vezes com 25 mililitros de água do ovo e agitando, descartando a água do ovo após cada lavagem. Após a última lavagem, imobilize as larvas com metade da concentração de tricaína usada anteriormente para evitar edema cardíaco e morte nas larvas tratadas com MTZ. Em seguida, use o filtro CFP em um microscópio de epifluorescência para avaliar os níveis de ablação de hepatócitos com base no tamanho relativo do fígado das lavas tratadas com MTZ. Considere o peixe-zebra com fígados grandes representando 0% a 5% das larvas como não ablação, aqueles com fígados de tamanho médio representando 10% a 20% das larvas parcialmente ablacionadas e aqueles com fígados muito pequenos representando 80% a 90% das larvas totalmente ablação.