Axotomia a laser de dois fótons: um método para ferir axônios em embriões de peixe-zebra e observar a recuperação axonal

- Coloque embriões de interesse em fenil tioureia, PTU, solução de Ringer para inibir a formação de pigmentos, que começa 24 horas após a fertilização. Isso torna a anatomia em desenvolvimento mais visível, o que é necessário para este procedimento. Transfira um embrião anestesiado com tricaína para uma câmara de imagem. Coloque uma lâmina de vidro em cima e visualize-a sob o microscópio. Concentre-se no axônio a ser ferido, que é visível sob um laser de 488 nanômetros porque expressa transgeneticamente a GFP.

Tire uma imagem anterior do site. Em seguida, visualize o axônio com um laser de 910 nanômetros que faz com que a GFP fique fluorescente em vermelho. Aumente a intensidade deste laser para ferir a área-alvo sem afetar o tecido circundante. Esse processo é chamado de axotomia. Tire uma nova imagem com o primeiro laser para confirmar a axotomia, que aparece como detritos espalhados. No protocolo a seguir, realizaremos uma axotomia de axônios sensoriais periféricos em embriões de peixe-zebra usando um laser de dois fótons.

- Se um escopo de dois fótons personalizado não estiver disponível em seu laboratório, o microscópio confocal de dois fótons Zeiss 510 também pode ser usado para cortar axônios. Começamos colocando o embrião montado no palco e colocando-o em foco usando uma objetiva de água 25x. Em seguida, ligue os dois lasers de fótons e argônios em uma configuração multipista para que seja possível alternar de um para o outro.

Embora ambos os lasers sejam usados para detectar GFP, a emissão de dois fótons é visualizada com vermelho e a emissão de laser de argônio com verde para diferenciar os dois. Use o laser de argônio para identificar um axônio para ferir. Em Configurações Z, marque a primeira e a última seções ópticas, tire uma imagem confocal e crie uma projeção máxima da pilha Z.

Desligue o laser de argônio e ligue o laser de dois fótons. Faça a varredura com uma intensidade de cerca de 9% de transmissão para garantir que o axônio ainda esteja em foco. Clique no botão Parar para que a ferramenta Cortar esteja disponível. Use Cortar para ampliar a área de interesse. Normalmente, ampliamos para cerca de 70x. Escolha a região do axônio a ser lesionada e coloque essa região em foco. O zoom pode ser verificado na guia Modo.

Em seguida, na guia Canais, altere a intensidade dos dois fótons de cerca de 9% de transmissão para 15% a 30% de transmissão. Para ativar as novas configurações, clique no botão Fast XY e, em seguida, clique em Parar rapidamente depois para evitar danos excessivos. O axônio deve ser visto como detritos espalhados se o procedimento funcionar. Finalmente, para garantir que o axônio foi realmente danificado, volte para o laser de argônio de 488 nanômetros. Pegue outra imagem confocal e crie uma projeção máxima das pilhas Z.