Axotomia a laser de dois fótons: um método para ferir axônios em embriões de peixe-zebra e observar a recuperação axonal

- Coloque embriões de interesse em fenil tioureia, PTU, solução de Ringer para inibir a formação de pigmentos, que começa 24 horas após a fertilização. Isso torna a anatomia em desenvolvimento mais visível, o que é necessário para este procedimento. Transfira um embrião anestesiado com tricaína para uma câmara de imagem. Coloque uma lâmina de vidro em cima e visualize-a sob o microscópio. Concentre-se no axônio a ser ferido, que é visível sob um laser de 488 nanômetros porque expressa transgeneticamente a GFP.

Tire uma imagem anterior do site. Em seguida, visualize o axônio com um laser de 910 nanômetros que faz com que a GFP fique fluorescente em vermelho. Aumente a intensidade deste laser para ferir a área-alvo sem afetar o tecido circundante. Esse processo é chamado de axotomia. Tire uma nova imagem com o primeiro laser para confirmar a axotomia, que aparece como detritos espalhados. No protocolo a seguir, realizaremos uma axotomia de axônios sensoriais periféricos em embriões de peixe-zebra usando um laser de dois fótons.

- Se um escopo de dois fótons personalizado não estiver disponível em seu laboratório, o microscópio confocal de dois fótons Zeiss 510 também pode ser usado p