Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

O objetivo geral deste procedimento é preparar o tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica imunológica. Isso é realizado primeiramente fixando o cérebro por meio de perfusão do animal. O segundo passo do procedimento consiste em cortar o cérebro e processar as seções para imunohistoquímica.

O terceiro passo do procedimento é osseccionar, desidratar e embutir as seções. O passo final do procedimento é cortar seções ultrfinas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram, com alta resolução espacial, a distribuição de várias proteínas em diferentes regiões e tipos celulares do sistema nervoso central.

Olá, sou Maria Trombley do Laboratório de Esca, do Departamento de Neurobiologia e Anatomia da Universidade de Rochester. Hoje vamos mostrar um procedimento para o preparo de tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica imunológica. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as interações entre micróglias e sinapses durante o desenvolvimento, a plasticidade dependente da experiência e o envelhecimento.

Então vamos começar. Após fixar o cérebro do camundongo por meio de perfusão intracardíaca, submetê-lo à pós-fixação em aproximadamente 10 mililitros de formaldeído a quatro graus Celsius por duas horas. Lavar o cérebro com um XPBS gelado a quatro graus Celsius, três vezes, durante 10 minutos cada lavagem, utilizando um vibrador, e imediatamente seccionar o cérebro em cortes transversais de 50 mícrons.

Use um pincel fino para transferir as seções selecionadas para um frasco de vidro contendo quatro graus Celsius. Armazene as seções restantes em XPBS com crioprotetor a menos 20 graus Celsius por até vários anos sem alteração. Processe no máximo 10 seções livres para coloração em cada frasco de vidro.

Use uma pipeta de transferência para substituir o XPBS por uma solução fresca de 0,1% borohidreto de sódio em PBS, trocando as soluções rapidamente para evitar que os cortes sequem. Incube por 30 minutos, lave os cortes com XPBS três vezes por 10 minutos cada. Tendo o cuidado de remover todas as bolhas, bloqueie com XPBS contendo 0,5% de gelatina e 5% de soro normal apropriado para o anticorpo secundário que será utilizado.

Incube por duas horas. Adicione o anticorpo primário diluído na solução bloqueadora. Incube por 48 horas.

Lave com um XPB S três vezes por 10 minutos. Incube cada um com anticorpo secundário conjugado à biotina diluído na solução bloqueadora por duas horas. Lave três vezes por 10 minutos em um XPBS, como antes.

Incube com estreptavidina peroxidase de rábano-picante diluída na solução bloqueadora por uma hora. Lave as seções uma vez em um XPBS e duas vezes em um XTBS durante 10 minutos cada. Para revelar a marcação, incube as seções com uma solução recém-preparada contendo 0,05% de dab e 0,01% de peróxido de hidrogênio em um XTBS.

Quando a coloração estiver marrom-escura visivelmente ou a reação tiver prosseguido por cinco minutos, lave os cortes com um XTBS para interromper a reação. Em seguida, lave uma vez com um XTBS e duas vezes com um x PB durante 10 minutos cada. Em uma cabine de segurança, use um pincel fino para transferir os cortes para uma placa de cultura multi-poços preenchida com um XPB.

Remova o PB de um poço usando um pincel fino para espalhar imediatamente os cortes em uma posição plana. Adicione uma solução de 1% de tetróxido de ósmio em um x PB antes de passar para o próximo poço, incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira os cortes de OSM para frascos de vidro.

Lave com um XPB por três vezes durante 10 minutos. Desidrate as seções em concentrações crescentes de etanol. Em seguida, use óxido de propileno conforme descrito na parte textual deste protocolo.

Use um pincel fino lavado com óxido de propileno para transferir as seções para resina dupant recém-preparada. Para a impregnação durante a noite, coloque a placa contendo as seções em uma estufa a 55 graus Celsius por 10 minutos. Para amolecer a resina, use um pincel lavado com óxido de propileno para revestir um filme de inclusão em cloro com uma camada fina de resina.

Transfira a seção para o filme e cubra com outro filme de inclusão, distribuindo uniformemente pesos leves de cerca de dois gramas na parte superior para ajudar na distribuição da resina. Deixe a resina polimerizar a 55 graus Celsius por 48 a 72 horas em uma incubadora. Após a polimerização, remova os pesos na camada superior do filme de inclusão sob um microscópio binocular.

Selecione áreas de interesse de dois por dois milímetros e use uma lâmina de barbear para removê-las do filme. Cole as áreas de interesse nas pontas dos blocos de resina com Super Bonder. Incube no forno a 55 °C por uma hora.

Use uma lâmina de barbear para cortar o bloco de resina no formato de um trapézio isósceles, a forma ideal para a sucção ultrafina. Usando um micrótomo e uma lâmina de vidro, remova a cola na superfície do tecido para obter uma superfície plana. Para sucção.

Encha o barquinho da lâmina de vidro com água bidestilada e corte algumas seções entre 0,5 e um mícron. Use um laço perfeito para transferir as seções para uma lâmina super frost. Seque em uma placa aquecida a 80 graus Celsius por um minuto e cora com azul de tuilina 0,1% por um minuto.

Use uma garrafa com pulverizador para remover o excesso de corante com água bidestilada. Sob um microscópio óptico, examine as seções para distinguir o tecido corado da resina. Corte seções semifinas até que a borda entre o tecido e a resina alcance aproximadamente o centro da seção. Substitua a lâmina de vidro por uma lâmina de diamante e encha o barquinho com água bidestilada.

Corte a prata até obter lâminas ultrfinas de cor prata dourada. Seccione com espessura de 60 a 80 nanômetros. Use pinças finas invertidas para coletar cuidadosamente as seções em grades de malha de cobre.

Seque as grades em papel filtro para realçar o contraste. Use pinças finas invertidas para transferir uma grade para uma gota de citrato de chumbo durante dois minutos. Enxágue delicadamente a grade mergulhando-a em três banhos sucessivos de água destilada duplamente.

Seque a grade em papel filtro e guarde-a em uma caixa para grades para exame posterior no microscópio eletrônico. Examine as grades no microscópio eletrônico para visualizar a imunomarcação, bem como a morfologia dos elementos celulares, suas organelas intracelulares e as relações entre elas.

Aqui, apresenta-se uma imunomarcação representativa para IBA1 no nível microscópico luminoso. A distribuição celular de IBA1 está restrita aos micróglios, o que confirma sua especificidade no nível microscópico eletrônico. IBA1, micróglios imunomarcados com pericário e processos visíveis.

A coloração imunoperoxidásica com DAB aparece como um precipitado denso ao elétron. Outros exemplos de IBA1, processos microgliais imunomarcados exibem diferentes tamanhos e formas. O aumento maior revela várias organelas intracelulares no interior de um dos processos microgliais, bem como as relações ultraestruturais entre outro processo microglial e elementos próximos do neuropil, incluindo sinapses.

Acabamos de mostrar como preparar o tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica imuno-histoquímica. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir rigorosamente todos os passos e manipular o tecido cerebral com delicadeza. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.