JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:19 min • April 30th, 2023
Lentivirus é um retrovírus que contém material genético de RNA. Este vírus fornece um método eficiente e estável de introdução de transgenes em linhagens de células cancerígenas. Comece adicionando neuraminidase a um tubo contendo lentivírus que expressa proteína fluorescente verde, ou GFP. Mantenha o tubo a 37 graus Celsius por uma hora para aumentar a eficiência de ligação do vírus.
Em seguida, centrifugue um tubo contendo suspensão de células tumorais para formar um pellet. Adicione meios de mamosfera contendo polibreno para ressuspender as células. Polybrene é um polímero catiônico que aumenta a eficiência da infecção lentiviral. Agora coloque o número ideal de células tumorais por poço em uma placa de cultura de tecidos de seis poços. Adicione a quantidade necessária de lentivírus em cada poço da placa de cultura.
Gire o prato para misturar o conteúdo e mantenha a 37 graus Celsius por 96 horas com um suprimento contínuo de dióxido de carbono. O lentivírus entra na célula e libera RNA. A transcriptase reversa viral converte o RNA em DNA de fita dupla que se integra ao genoma do hospedeiro. Coloque a placa sob um microscópio fluorescente e monitore as células para uma transdução bem-sucedida. As células transduzidas fluorescem devido à expressão de GFP.
No protocolo de exemplo, realizaremos a transdução de células tumorais dissociadas em PDX com vetores lentivirais.
Para transduzir as células tumorais, centrifugar as células isoladas para ressuspensão em dois mililitros de meio de mamosfera. Após a contagem, centrifugue novamente as células e ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio de mamosfera, complementado com 20 microlitros de polibreno. Em seguida, placa 2 vezes 10 elevado à quinta células tumorais viáveis por poço em uma placa de cultura de tecidos de seis poços de adesão ultrabaixa e partículas lentivirais nas células em uma multiplicidade de infecção de 10.
Gire a placa para misturar o vírus com as células e incube as coculturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por até 96 horas, adicionando 500 microlitros de meio fresco da mamosfera após as primeiras 24 horas. Quando pelo menos 10% das células forem positivas para GFP, transfira as células transduzidas de pelo menos um poço para um tubo cônico de 15 mililitros em gelo e lave o poço com um mililitro de meio de mamosfera.
Junte a lavagem com as células e centrifugue as células tumorais em 10 mililitros de HBSS mais HEPES. Finalmente, ressuspenda as células em 50 microlitros de extrato de matriz basal no gelo e carregue as células incorporadas em uma seringa de insulina de 0,5 mililitro para reimplante.