Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
É necessário ter uma assinatura JoVE para assistir este Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Lentivirus הוא רטרווירוס המכיל חומר גנטי RNA. וירוס זה מספק שיטה יעילה ויציבה של החדרת transgenes לקווי תאים סרטן. התחל על ידי הוספת neuraminidase לצינור המכיל Lentivirus המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP. שמור על הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי להגדיל את יעילות מחייב של הנגיף.
לאחר מכן, צנטריפוגה צינור המכיל השעיית תאים סרטניים כדי ליצור גלולה. הוסף מדיה ממוסיפרית המכילה פוליברן כדי לשימוש חוזר בתאים. פוליברן הוא פולימר קטיוני המגביר את יעילות הזיהום הלנטיביאלי. עכשיו צלחת את המספר האופטימלי של תאים סרטניים לכל באר בצלחת תרבית רקמות שש גם. הוסף את הכמות הנדרשת של Lentivirus לתוך כל באר של צלחת התרבות.
מערבבים את הצלחת כדי לערבב את התוכן, ולשמור על 37 מעלות צלזיוס במשך 96 שעות עם אספקה רציפה של פחמן דו חמצני. Lentivirus נכנס לתא ומשחרר RNA. התמלול ההפוך הנגיפי ממיר את הרנ"א לדנ"א כפול נטוש שמשתלב בגנום המארח. מניחים את הצלחת מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנטרים תאים להעברה מוצלחת. פלואורסצנטיות התאים שעברו חילוף עקב ביטוי GFP.
בפרוטוקול לדוגמה, נבצע התמרה של תאים סרטניים ניתוק PDX עם וקטורים Lentiviral.
כדי לתמר את תאי הגידול, צנטריפוגה התאים המבודדים עבור resuspension בשני מיליליטר של מדיום ממוספרה. לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים שוב ו resuspend גלולה בשני מיליליטר של מדיום mammosphere, בתוספת 20 microliters של פוליברן. לאחר מכן, צלחת 2 פעמים 10 לתאי הגידול קיימא החמישי לכל באר בדבקות נמוכה במיוחד שש צלחת תרבית רקמה גם חלקיקים Lentiviral לתאים בריבוי של זיהום של 10.
מערבבים את הצלחת כדי לערבב את הנגיף עם התאים ולהדגיר את התרבויות המשותפות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד 96 שעות, הוספת 500 microliters של מדיום mammosphere טרי לאחר 24 השעות הראשונות. כאשר לפחות 10% מהתאים הם חיוביים GFP, להעביר את התאים transduced מבאר אחת לפחות לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר על הקרח ולשטוף את הבאר עם מיליליטר אחד של מדיום ממוספרה.
בריכה לשטוף עם התאים צנטריפוגה התאים הגידול ב 10 מיליליטר של HBSS בתוספת HEPES. לבסוף, resuspend התאים ב 50 microliters של תמצית מטריצת מרתף על קרח לטעון את התאים המוטבעים לתוך מזרק אינסולין 0.5 מיליליטר להשתלה מחדש.
