Inflação de tinta nanquim: um método de coloração para visualizar nódulos tumorais

Comece colocando um camundongo sacrificado com o lado ventral para cima em uma cama cirúrgica e prendendo os membros do animal. Usando uma tesoura, corte ao longo da linha média através da caixa torácica até as glândulas salivares. Coloque uma ponta de pipeta embaixo da traqueia para elevá-la e isolá-la. Gire a cama cirúrgica 180 graus. Insira uma agulha de seringa contendo uma mancha de tinta nanquim na traqueia e injete a tinta nos pulmões até sentir resistência.

As células cancerígenas secretam uma grande quantidade de ácido lático que gera uma forte carga negativa na superfície celular. Quando essas células são coradas com tinta nanquim, uma mancha ácida, a superfície celular repele a mancha e permanece sem coloração.

Use uma tesoura para cortar a traqueia e deslize uma pinça sob os pulmões. Puxe suavemente os pulmões para fora do corpo do animal. Enxágue os pulmões em água e transfira-os para um frasco contendo a solução de Fekete para remover o excesso de manchas e fixar o tecido em uma capela de exaustão. Os nódulos tumorais aparecem brancos contra o fundo escuro.

No protocolo a seguir, realizaremos a técnica de insuflação com tinta nanquim para validar metástases pulmonares.

Para validar a metástase do tumor primário para o pulmão, primeiro coloque o camundongo em decúbito dorsal em uma placa de poliestireno e prenda as pernas para garantir um acesso desobstruído à traqueia. Pulverize o mouse com etanol 70%. Em seguida, use uma tesoura para fazer uma incisão ao longo da linha média do abdômen médio do camundongo através da caixa torácica e em direção às glândulas salivares. Identifique a traqueia. Em seguida, use uma pinça para remover os tecidos circundantes.

Em seguida, segurando uma ponta de pipeta em uma mão, enfie a ponta sob a traqueia e levante suavemente o tecido para cima e para longe do corpo. Mantendo a traqueia elevada, gire a plataforma de dissecação 180 graus. Em seguida, insira uma seringa de tuberculina de calibre 27 cc na traqueia e infle completamente os pulmões com tinta nanquim até sentir uma forte resistência.

Em seguida, usando uma tesoura, corte a traqueia. Segurando o mouse no lugar com uma pinça, insira outra pinça sob os pulmões e puxe os lobos pulmonares para fora do mouse. Enxágue brevemente os pulmões em um copo de água e transfira o tecido para uma capela de exaustão. Em seguida, coloque os pulmões em um frasco de cintilação de vidro contendo 3 mililitros da solução de Fekete, tampando o frasco para evitar que a solução evapore. Após alguns minutos, transfira os pulmões para uma placa de Petri e conte o número de nódulos tumorais metastáticos brancos únicos.