Ensaio de formação de colônias de ágar mole: um método para testar os efeitos de novos compostos na proliferação de células cancerígenas

Para começar, pegue uma concentração apropriada de agarose derretida em um tubo cônico e adicione uma quantidade desejada de meio de cultura quente a ele. Inverta suavemente para misturar o conteúdo. Adicione esta mistura em cada poço de uma placa de seis poços e deixe solidificar. Esta é a camada inferior. Em seguida, trate as células cancerígenas com o composto de interesse e adicione a concentração necessária de agarose.

Agora, despeje esta mistura contendo o número desejado de células por mililitro em cada poço. Esta é uma camada contendo células. Assim que o meio solidificar, incube a placa a 37 graus Celsius por uma semana. Prepare uma camada alimentadora misturando agarose ao meio e complemente essa mistura com o composto de interesse. Adicione suavemente esta camada de alimentação em cada poço, deixe-a solidificar e incube a placa a 37 graus Celsius.

Repita este procedimento de alimentação semanalmente para reabastecer as células com o meio até que as colônias se formem. Se o composto de interesse for um inibidor da tumorigenicidade, ele suprimirá o crescimento das células, resultando em poucas colônias nos poços. No protocolo a seguir, realizaremos um ensaio de formação de colônias de ágar mole para estudar o efeito dos inibidores de PADI na tumorigenicidade de células de câncer de mama.

Comece este procedimento preparando 3% de 2-hidroxietilagarose. Em uma garrafa de vidro limpa e seca de 100 mililitros, adicione 0,9 gramas de agarose 2-hidroxietil seguida de 30 mililitros de água destilada. Microondas a mistura por 15 segundos e agite suavemente. Repita esta etapa até que o pó de agarose se dissolva completamente. Em seguida, autoclave a solução contendo o frasco por 15 minutos.

Deixe a solução de agarose esfriar até a temperatura ambiente antes de usá-la novamente. Pré-aqueça várias pipetas de cinco mililitros e 10 mililitros em uma incubadora a 37 graus Celsius para evitar que a agarose se solidifique na pipeta durante o manuseio. Afrouxe parcialmente a tampa da garrafa e leve ao micro-ondas a solução pré-fabricada de agarose 2-hidroxietil a 3% por 15 segundos. Em seguida, gire suavemente a solução e leve ao microondas por mais 15 segundos.

Tenha cuidado ao agitar a solução de agarose, pois a solução sobe quando exposta ao ar e pode transbordar. Se houver gel sólido residual na garrafa, leve ao microondas por mais alguns segundos. Mantenha o frasco contendo a solução de agarose em banho-maria a 45 graus Celsius durante as próximas etapas para evitar que a solução de agarose solidifique prematuramente.

Em seguida, transfira 12 mililitros de meio aquecido usando as pipetas pré-aquecidas para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Adicione imediatamente três mililitros da solução de agarose a 3% e inverta suavemente o tubo cônico para misturar a agarose com o meio. Em seguida, adicione delicadamente dois mililitros dessa mistura em cada poço de uma placa de cultura de seis poços sem formar bolhas de ar. Incube a placa de cultura de seis poços horizontalmente em uma superfície plana a quatro graus Celsius por uma hora para permitir que a mistura solidifique.

Depois que a mistura solidificar, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos. A camada inferior agora está pronta para uso.

Um aspecto difícil deste procedimento é garantir que todas as células sejam distribuídas igualmente e que o gel de agarose derretido não solidifique antes de ser adicionado a cada poço, para garantir que as células sejam misturadas no meio antes de adicionar o gel de agarose líquido. Além disso, as pipetas são pré-aquecidas previamente para evitar que as soluções se solidifiquem durante o manuseio.

Para preparar a camada que contém a célula, primeiro tripsinize MCF10DCIS células e dilua-as até uma concentração celular de 40.000 células por mililitro. Em seguida, pegue oito mililitros de meio usando pipetas pré-aquecidas e transfira para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Adicione imediatamente dois mililitros de agarose a 3% ao tubo cônico e inverta suavemente para misturar a agarose com a mídia. Evite formar bolhas.

Em seguida, pegue dois mililitros das células e trate-as com dois micromolares de BB-cloro-amidina em DMSO, ou DMSO sozinho como controle. Após o tratamento, misture as células com uma agarose a 0,6% em uma diluição de um para um para fazer uma concentração final de um BB-cloro-amidina. Em seguida, pegue um mililitro da mistura de célula e agarose e adicione delicadamente na camada inferior da placa de cultura de seis poços.

Coloque a placa de cultura de seis poços horizontalmente em uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidifique. Depois que a mistura solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma semana antes de adicionar a camada de alimentação. Comece a preparação da camada de alimentação colocando no micro-ondas a solução pré-fabricada de agarose 2-hidroxietil a 3% como antes e equilibrando o frasco da solução de agarose em banho-maria a 45 graus Celsius.

Misture um mililitro de solução de agarose a 3% com nove mililitros de meio quente em um tubo cônico de 50 mililitros e inverta suavemente para misturar a agarose com o meio. Evite formar bolhas de ar. Depois de tratar a mistura com BB-cloro-amidina, adicione suavemente um mililitro da mistura em cada poço da placa de cultura de seis poços contendo as camadas inferior e macia. Em seguida, coloque a placa de cultura de seis poços horizontalmente em uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura solidifique.

Depois que a camada de alimentação solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius. Repita este procedimento de alimentação semanalmente, sobrepondo um mililitro de solução de tratamento com meio de agarose a 0,3% na camada alimentadora existente para reabastecer as células com novos meios até que a formação de colônias seja observada.