JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 5:55 min • April 30th, 2023
- Primeiro, coloque um rato sacrificado em uma placa de dissecação. Logo acima do abdômen, corte a pele e o peritônio. Perfure o diafragma e corte ao longo das costelas e da caixa torácica até a traqueia. Faça uma pequena incisão na traqueia. Insira suavemente uma agulha dentro da traqueia sem ferir a carina e prenda-a com uma pinça. Injete agarose de baixo ponto de fusão à temperatura corporal normal dentro dos pulmões. Remova lentamente a seringa e mantenha a agulha dentro para evitar o refluxo da agarose.
Despeje PBS frio nos pulmões para promover a gelificação de agarose. Remova a agulha e prenda a traqueia com uma pinça para evitar o refluxo de agarose não solidificada. Abra o esterno, segure a traqueia com uma pinça e corte-a com uma tesoura. Retire os pulmões da cavidade torácica. Separe os lóbulos na mídia. Coloque dentro de poços de imagem sob condições fisiológicas para microscopia. A agarose preserva a morfologia pulmonar em temperaturas fisiológicas que ajudam a observar as interações celulares vivas. No protocolo a seguir, demonstraremos imagens ao vivo ex vivo de pulmões para estudar as interações entre células cancerígenas e células estromais.
- Para preparar os pulmões para imagens ao vivo ex vivo, comece imobilizando o camundongo em uma tampa de espuma de poliestireno coberta com um pedaço de imersão e esterilize o animal com etanol a 70%. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão epigástrica transversal através da pele, seguida de uma incisão semelhante através do peritônio. Em seguida, movendo a placa de dissecção para a posição vertical, corte a aorta descendente para que o sangue se acumule no abdômen e não na cavidade torácica.
Corte uma pequena abertura no diafragma para liberar o vácuo e, em seguida, corte ao longo da caixa torácica para extirpar o diafragma e visualizar os pulmões. Usando uma tesoura cirúrgica, corte a pele até a traqueia sobre a caixa torácica, deixando as costelas intactas. Em seguida, separe a pele da caixa torácica e remova o tecido conjuntivo circundante para expor a traqueia, tomando cuidado para não danificar a própria traqueia. Corte uma pequena abertura de aproximadamente 1 milímetro de diâmetro na traqueia exposta paralela aos anéis cartilaginosos o mais próximo possível da laringe, sem cortar completamente a traqueia.
Em seguida, insira suavemente uma agulha de calibre 20 de 4 a 5 milímetros na traqueia sem qualquer força contrária. A extremidade da agulha deve ser visível através da traqueia. Encha uma seringa com 400 microlitros de agarose de baixa temperatura de fusão a 37 graus Celsius a 2% e, em seguida, estabilize a agulha com uma pinça. Mantendo a placa de dissecação na vertical, instile lentamente toda a quantidade de agarose quente através da agulha nos pulmões. Assim que os pulmões estiverem inflados, retire a seringa enquanto mantém a agulha dentro da traqueia e despeje aproximadamente 50 mililitros de PBS a 20 graus Celsius sobre os pulmões para ajudar a fixar a agarose.
Quando a agarose estiver solidificada, remova a agulha e use uma pinça para fechar a traqueia para evitar o vazamento de qualquer agarose não solidificada. Agora, abra ainda mais o peito por esternotomia e segure a traqueia com uma pinça. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, corte completamente a traqueia. Para remover os pulmões, puxe suavemente a traqueia para cima, corte o tecido conjuntivo e o esôfago e puxe os pulmões completamente para fora da cavidade torácica.
Mergulhe o tecido em 37 graus Celsius RPMI 1640 para lavar o excesso de sangue. Usando uma tesoura e uma pinça, corte o brônquio do tronco principal dos lobos no hilo e separe suavemente os lobos pulmonares. Transfira os lóbulos para um poço de uma placa de imagem de 24 poços, superfície plana para baixo e cubra o tecido com 100 microlitros de 37 graus Celsius RPMI 1640. Coloque várias lâminas de cobertura de microscópio circular de 15 mililitros em cima dos lóbulos para evitar que flutuem e despeje PBS quente nos poços circundantes para evitar que o meio evapore. Em seguida, insira a placa de 24 poços na câmara climática e transfira a câmara para o estágio do microscópio confocal.