Cultura tridimensional de células de carcinoma de pulmão: um método para estudar as interações célula-matriz
JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:45 min • April 30th, 2023
- Primeiro, descongele os frascos da matriz da membrana basal a 4 graus Celsius durante a noite. A matriz da membrana basal consiste em proteínas presentes no microambiente tumoral que ajudam a manter as características das células cancerígenas in vitro. No dia seguinte, coloque o frasco da matriz da membrana basal no gelo para reter a matriz no estado líquido. Leve as células de câncer de pulmão para um tubo de centrífuga pré-resfriado e centrifugue a 4 graus Celsius. Aspire o sobrenadante e bata suavemente para desalojar o pellet e colocá-lo no gelo. Em seguida, adicione um volume apropriado de mistura de membrana basal a este tubo e misture para fazer uma suspensão celular uniforme. Execute todas as etapas em baixa temperatura para evitar que a membrana basal gelifique.
Transfira um volume apropriado de suspensão de matriz celular para o centro de cada poço em uma placa de poço pré-resfriada, cobrindo todo o poço. Incube a placa do poço para que a matriz se solidifique. Examine ao microscópio para garantir uma distribuição uniforme das células dentro da matriz. Adicione meio completo de cultura 3D em cada poço e incube a 37 graus Celsius. Este meio facilita as interações da matriz celular. Assim, as células formam organoides com estruturas semelhantes a acinares. No protocolo a seguir, realizaremos a cultura 3D de células de carcinoma de pulmão TUM622.
Para começar, descongele os frascos da matriz da membrana basal em uma geladeira de 4 graus Celsius durante a noite. Resfrie duas pipetas de plástico de mililitros e pontas a menos 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aqueça os reagentes usados para dissociar as células TUM622, tampão HEPES, tripsina-EDTA e tampão de neutralização de tripsina em banho-maria a 37 graus Celsius. Retire a matriz da membrana basal descongelada da geladeira e coloque o frasco no gelo. Resfrie as placas de cultura de tecidos em um refrigerador de plataforma de metal colocado no gelo. Coloque os tubos da centrífuga em uma prateleira de resfriamento de metal no gelo. Calcule a quantidade de células necessárias, com base no número de poços e na concentração de células em cada poço, a serem preparadas. Transfira a suspensão da célula TUM622 para um tubo de centrífuga resfriado e gire para baixo a 300 vezes g em uma centrífuga de balde suspensa a 4 graus Celsius por cinco minutos.
Com uma pipeta de aspiração acoplada a uma ponta não filtrada, aspire o sobrenadante com cuidado, deixando aproximadamente 100 microlitros do meio no tubo. Bata suavemente na lateral do tubo para desalojar e associar o pellet e, em seguida, retorne-o ao rack de resfriamento. Usando as pipetas pré-resfriadas de dois mililitros, misture suavemente a matriz no gelo pipetando para cima e para baixo algumas vezes. Pipete a uma velocidade uniforme e moderada para que não sejam introduzidas bolhas na matriz durante este procedimento.
Transfira 1,1 mililitros da matriz para cada tubo de centrífuga. Usando pontas pré-resfriadas, pipete a matriz em cada tubo para cima e para baixo cerca de 10 vezes para fazer uma suspensão celular uniforme. Transfira 310 microlitros da suspensão da matriz celular para cada poço de uma placa pré-resfriada de 24 poços. Coloque a pipeta em um ângulo de 90 graus em relação à superfície da placa e adicione a suspensão ao centro do poço. A suspensão se espalha e cobre todo o poço. Para facilitar a análise de imunofluorescência a jusante, transfira 60 microlitros de suspensão de matriz celular para o centro do poço de uma lâmina de câmara de 2 poços. Isso permite que a matriz forme uma estrutura semelhante a uma cúpula com volume muito menor.
Retorne a placa e a lâmina da câmara de volta para a incubadora de cultura de tecidos e incube por 30 minutos para permitir que a matriz se solidifique. Depois disso, examine a placa e deslize sob um microscópio de luz para garantir que as células individuais sejam distribuídas uniformemente dentro da matriz. Adicione 1 mililitro de meio completo de cultura 3D pré-aquecido em cada poço da placa e 1,5 mililitros de meio de cultura 3D em cada poço da lâmina da câmara. Em seguida, devolva-os à incubadora.
Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para o cultivo tridimensional de células de carcinoma pulmonar TUM622 utilizando uma matriz da membrana basal. O método enfatiza a manutenção de temperaturas baixas durante a preparação para evitar a gelificação da matriz.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Cultura celular
- Biologia do câncer
- Engenharia de tecidos 3D
Contexto
- A matriz da membrana basal é crucial para manter as características das células cancerígenas in vitro.
- Culturas 3D podem imitar melhor o microambiente tumoral em comparação com culturas tradicionais 2D.
- As estruturas de organoides formadas em culturas 3D podem fornecer informações sobre a biologia do câncer.
- O controle de temperatura é essencial para evitar a solidificação prematura da matriz.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para o cultivo de células de carcinoma pulmonar em um ambiente tridimensional.
- Facilitar o estudo das interações entre células e matriz na pesquisa do câncer.
- Permitir a formação de organoides com estruturas semelhantes a ácinos para análises posteriores.
Métodos Utilizados
- Descongelamento e preparação da matriz da membrana basal em temperaturas baixas.
- Centrifugação de células de câncer de pulmão TUM622 para criar um pellet celular.
- Mistura da suspensão celular com a matriz da membrana basal.
- Transferência da mistura para placas de poços e incubação para solidificação.
Resultados Principais
- Formação bem-sucedida de uma suspensão uniforme de células na matriz.
- Distribuição homogênea das células dentro da matriz confirmada ao microscópio.
- Organoides com estruturas semelhantes a acinos foram formados após a incubação.
- O meio de cultura 3D facilitou o crescimento e a interação celulares.
Conclusões
- O protocolo fornece um método reprodutível para o cultivo tridimensional de células de carcinoma pulmonar.
- Mantém-se essencial a baixa temperatura para a integridade da matriz.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão da biologia do câncer por meio de um modelamento melhorado do microambiente tumoral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o cultivo tridimensional reprodutível de células de carcinoma pulmonar para modelar interações célula-matriz, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos em oncologia. Ao formar estruturas semelhantes a organoides em uma matriz de membrana basal, o método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao recapitular melhor o microambiente tumoral. Ele fornece um sistema padronizado e escalonável para a desmistificação mecanicista de alvos terapêuticos na pesquisa do câncer de pulmão.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das interações entre tumor e estroma e a modulação de vias em um contexto fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao manter as características das células cancerígenas por meio de sinais da matriz extracelular.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nos alvos ao reduzir falsos positivos decorrentes de artefatos de culturas artificiais em 2D.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas baseadas em microscopia da formação de organoides e desenvolvimento de estruturas semelhantes a ácinos.
- Valor Operacional: Padroniza as condições do ensaio por meio da preparação da matriz com controle de temperatura e distribuição uniforme de células.
- Escalabilidade: Compatível com placas de 24 poços e lâminas com câmara para análise de imagem e imunofluorescência de médio a alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao modelar a progressão do carcinoma de pulmão escamoso em um sistema relevante para a doença.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação dos efeitos do composto sobre a adesão célula-matriz, invasão e morfogênese de organoides.
- Confiabilidade Preditiva: Aprimora a relevância dos resultados pré-clínicos ao capturar a arquitetura tecidual tridimensional e as interações estromais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo a avaliação precoce de alvos e a otimização de compostos líderes por meio de maior fidelidade biológica.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre vias de sinalização dependentes da matriz e potencial tumorigênico.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para triagem de bibliotecas de compostos em formatos tridimensionais.
- Análises: Oferece medições baseadas em morfometria e fluorescência para comparar os efeitos de tratamentos na formação de organoides.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores ao preservar interações do microambiente tumoral críticas para a progressão do câncer.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o desenvolvimento de modelos de câncer de pulmão em múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a validade preditiva dos modelos de câncer de pulmão ao permitir estudos de interação célula-matriz.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados para manipulação de matriz sensível à temperatura.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de falhas ao melhorar a relevância biológica das avaliações pré-clínicas de eficácia e toxicidade.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões baseadas em dados sobre continuidade ou interrupção de projetos por meio de maior fidelidade do modelo em programas de câncer de pulmão.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultivo celular tridimensional e manipulação de matriz extracelular.
- Depende de logística de cadeia fria e equipamentos com controle de temperatura para a preparação da matriz.
- Necessita de procedimentos operacionais padronizados entre as equipes para garantir a formação consistente de organoides.
- A adaptação a outros modelos de carcinoma pode exigir a otimização da concentração da matriz e da densidade celular.
- Limitado pela necessidade de ferramentas de imagem especializadas para avaliar os resultados estruturais tridimensionais.
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Última atualização: 29 agosto 2026