Co-cultura 3D de células de câncer de pulmão com CAFs: um sistema modelo in vitro para estudar a progressão do tumor

- Em co-culturas 3D, vários tipos de células são cultivados juntos em matrizes como uma matriz de membrana basal, que imita o microambiente natural da matriz extracelular, facilitando as interações célula-célula e célula-matriz. Para estabelecer uma co-cultura 3D incorporada, prepare uma suspensão uniforme de fibroblastos associados ao câncer ou CAFs e células de câncer de pulmão tomadas em duas proporções é para uma, na matriz da membrana basal. Mantenha a suspensão no gelo para evitar a solidificação da matriz à temperatura ambiente.

Transferir um volume adequado de suspensão para uma placa de cultura de células. Incube a 37 graus Celsius pela duração necessária para co-incorporar as células na matriz. Para estabelecer uma co-cultura 3D sobreposta, prepare uma suspensão de células de câncer de pulmão na matriz da membrana basal, na densidade celular desejada. Mantenha a suspensão no gelo. Pipetar um volume adequado desta suspensão de matriz celular para uma placa de cultura de células. Incube a 37 graus Celsius para configurar a monocultura de células cancerígenas incorporadas.

Posteriormente, transfira o volume desejado de CAFs suspensos em meios de cultura preferidos, sobre as células cancerígenas incorporadas. Em co-culturas 3D, os CAFs aumentam a formação de esferóides de células cancerígenas e atraem células cancerígenas, resultando em estruturas semelhantes a lágrimas. Neste protocolo, faremos co-cultura de células de câncer de pulmão TUM622 e CAFs para estudar sua interação.

- Depois de preparar as suspensões celulares de TUM622 e CAFs, conforme descrito anteriormente, conte a densidade celular CAF misturando 10 microlitros de suspensão celular com 10 microlitros de azul de tripano. Adicione 10 microlitros da mistura a cada uma das duas câmaras em um hemocitômetro para contar e calcular a densidade celular. Para co-incorporar células TUM622 e CAFs na matriz da membrana basal, primeiro calcule o número desejado de células usadas para o revestimento, com base nas informações de densidade celular. Os CAFs são semeados em uma proporção de 2 para 1 de células TUM622. Transfira o volume calculado de TUM622, bem como a suspensão de células CAF, para o mesmo tubo de centrífuga. Gire para baixo e aspire todos os meios. Ressuspenda na matriz da membrana basal e coloque 310 microlitros da mistura em cada poço de uma placa de 24 poços. Para imunofluorescência, transfira 60 microlitros de misturas TUM622 e CAF para lâminas de câmara conforme descrito anteriormente.

Para co-cultivar TUM622 com CAFs sobrepostos na matriz da membrana basal, primeiro configure a monocultura de TUM622 conforme descrito anteriormente. Transfira o dobro do número de suspensão CAF para um tubo de centrífuga e gire para baixo a 300 vezes 'g' por cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os CAFs em um mililitro de meio de cultura 3D. Transfira a suspensão CAF de um mililitro para o poço que contém as células TUM622 incorporadas.