JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 5:38 min • April 30th, 2023
- Para começar, semeie as células de câncer de pulmão em um frasco em T contendo meio de cultura de tecidos e deixe-o crescer durante a noite. Em seguida, suspenda o miRNA com um agente transfectivo em um meio transfectador. Remova o meio e adicione um meio de transfecção que introduzirá o miRNA nas células cancerígenas. O miRNA é uma molécula de RNA não codificante que se liga a uma sequência complementar de mRNA e bloqueia a expressão gênica. Incubar o balão durante o período desejado.
Em seguida, substitua o meio por meio de cultura de tecidos e cresça durante a noite. Adicione tripsina para dissociação celular. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga contendo PBS e centrifugue-o. Remova o sobrenadante e adicione tampão de lise para lisar as células e adicione etanol ultrapuro para precipitação. Colocar a mistura numa coluna de separação para purificar o ácido nucleico e centrifugar.
Remova o fluxo e adicione um tampão de lavagem para remover a membrana celular lisada e centrifugar. Remova o tampão de lavagem e adicione DNase com tampão de digestão DNase para remover o DNA da amostra e centrifugar. Adicione tampão de preparação de RNA para isolar o RNA e centrifugar. Colete o RNA presente no sobrenadante. No protocolo a seguir, realizaremos a extração de RNA de células de câncer de pulmão tratadas com miRNA.
- Primeiro, semeie as células cancerígenas em um frasco apropriado suficiente para extração de RNA e proteína para realizar a expressão gênica usando qPCR ou análise de microarray. Em seguida, incube durante a noite com meio suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
No dia seguinte, prepare a amostra de microRNA para transfecção diluindo o microRNA 143 e o microRNA 506 no meio, na concentração de 100 nanomolares cada. Retire o frasco da incubadora e remova a mídia. Lave com 1 x PBS.
Todos os controles não tratados conterão apenas mídia incompleta com células. Incubar as células com meios de transfecção por seis horas em uma incubadora. Após seis horas, remova a mídia e substitua por 4 mililitros de mídia completa nova. Colha as células após 24 horas e 48 horas por tripsinização.
Em seguida, lave duas vezes com 1x PBS em cada tubo e remova o sobrenadante. Para realizar a extração de RNA posteriormente, congele as células a menos 80 graus Celsius.
- A extração de RNA foi realizada usando um kit de RNA, seguindo as instruções do fabricante. Primeiro remova os tubos de menos 80 graus Celsius e deixe descongelar.
- Adicione 300 microlitros de tampão de lise e pipete para cima e para baixo para quebrar a membrana celular. Adicione o mesmo volume de 100% de etanol ultra puro. Em seguida, misture bem e coloque na coluna de separação. Centrifugue e remova o fluxo.
Adicione 400 microlitros de tampão de lavagem e centrifugue para remover o tampão. Adicione 5 microlitros de DNAse I com 75 microlitros de tampão de digestão de DNA em cada amostra e incube por 15 minutos. Em seguida, lave a amostra com tampão de preparação de RNA de 400 microlitros.
Em seguida, lave duas vezes com tampão de lavagem de RNA. Agora adicione água livre de nuclease à coluna, centrifugue e colete o RNA. Meça a concentração de RNA, nesta etapa, 2 microgramas de amostra de RNA podem ser enviados para o sequenciamento de RNA.