Microarray de anticorpos: uma técnica para estudar a expressão proteica de células de câncer de pulmão tratadas com miRNA

- Comece adicionando uma solução de biotina e um tampão de rotulagem à amostra de proteína. Incubar para facilitar a ligação da biotina às proteínas. Adicione um reagente de parada e vórtice. Em seguida, coloque uma lâmina de microarray de anticorpos em um prato contendo um reagente de bloqueio para evitar a ligação não específica de anticorpos. Lave a lâmina com água bidestilada para remover a solução de bloqueio. Coloque a lâmina de microarray em uma câmara. Misturar a amostra de proteína biotinilada com uma solução de acoplamento e adicionar na lâmina para facilitar a ligação das proteínas-alvo aos seus anticorpos correspondentes. Transfira a lâmina para um prato contendo um tampão de lavagem e substitua o tampão por água bidestilada duplamente. Em seguida, coloque a lâmina em um tampão de detecção contendo estreptavidina marcada com fluorescência para promover sua ligação às proteínas biotiniladas.

Incube o prato no escuro para manter a intensidade da fluorescência. Remova a lâmina e coloque-a em um scanner de microarray. O scanner procura sinais fluorescentes da estreptavidina ligada à proteína alvo. Com base na intensidade da fluorescência, o software analisa a extensão da expressão da proteína. No protocolo a seguir, realizamos um microarray de anticorpos para análise de alterações na expressão gênica associadas ao ciclo celular.

- Este experimento é para identificar todas as alterações na expressão das proteínas da via do ciclo celular pelo tratamento com microRNA. Colete amostras de proteínas de acordo com o procedimento descrito na seção de transfecção e quantifique com o ensaio BCA. Remova as lâminas de menos 4 graus Celsius uma hora antes do experimento para levar à temperatura ambiente e remover a umidade. Pegue 70 microgramas de amostras de proteínas e prepare as lâminas de amostra de acordo com as instruções do fabricante, que também são descritas passo a passo na seção de texto.

Aqui para observar, a lavagem adequada das lâminas com água deionizada ultrapura é outro passo importante, pois isso ajudará a reduzir o fundo das lâminas. Além disso, é muito crítico neste experimento não secar as lâminas de amostra até a etapa final. Finalmente, faça a varredura da lâmina usando a máquina do microarray e analise os dados.