Por que a temperatura da centrifugação é importante para o isolamento de miARN plasmático?

A centrifugação a 4 graus Celsius evita a lise celular e a liberação não específica de microRNAs de células sanguíneas, preservando a integridade da amostra para análise de biomarcadores.

Como a proteinase K protege o miRNA durante a extração?

A proteinase K degrada proteínas, incluindo nucleases, que de outra forma poderiam digerir o RNA durante o processamento posterior, garantindo a estabilidade do miRNA.

Qual é a finalidade do tratamento com DNase 1 no protocolo?

A DNase 1 remove a contaminação por DNA genômico da amostra, melhorando a especificidade da purificação de miRNA para aplicações posteriores.

Por que o plasma deve ser processado dentro de uma hora após a coleta?

O processamento imediato evita alterações celulares ex vivo e a liberação ou degradação de miRNAs, mantendo a fidelidade do perfil de biomarcadores circulantes.

Qual condição de armazenamento preserva a integridade do miRNA extraído?

Armazenar o miRNA eluído a menos 80 graus Celsius impede a degradação do RNA e garante adequação para estudos longitudinais de biomarcadores.

Extração de miRNA: Um método para extrair miRNA de amostra de plasma

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pesquisa sobre o Câncer

0 vistas • 3:59 min • April 30th, 2023

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- MicroRNAs, ou miRNAs, são pequenos RNAs não codificantes envolvidos na regulação gênica. Suas expressões são alteradas durante o câncer e, portanto, são potenciais biomarcadores de câncer. Para iniciar o isolamento do miRNA, pegue uma amostra de sangue total recém-coletada e centrifugue a 4 graus Celsius para separar o plasma das células sanguíneas. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar novamente para obter um sobrenadante de plasma mais límpido. Extrair o sobrenadante, tratar com solução de homogeneização refrigerada, seguida de tampão de lise para homogeneizar a amostra. Adicione a solução enzimática de proteinase K para degradar proteínas, particularmente as nucleases que, de outra forma, digeririam o RNA durante as etapas a jusante.

- Em seguida, carregue o lisado no poço designado de um cartucho extrator de ácido nucleico específico do instrumento pré-montado. Adicione a solução de DNase 1 ao poço apropriado para eliminar o DNA genômico da amostra. Adicione água livre de nuclease ao tubo de eluição montado no cartucho para condicionamento antes do isolamento do miRNA. Carregue o conjunto do cartucho no extrator de ácido nucleico. Selecione e execute o software de purificação de miRNA apropriado. Quando terminar, remova o tubo de eluição contendo miRNA e armazene a 80 graus Celsius negativos.

- No protocolo a seguir, mostramos a extração de miRNA de amostras de sangue de pacientes para rastreamento de câncer de pulmão.

- Para iniciar este protocolo, use tubos vacutainer para coletar 10 mililitros de amostra de sangue total. Armazene em temperatura ambiente.

- Não armazene sangue total em baixa temperatura, como 4 graus Celsius, para evitar choque térmico e lise celular que levam a uma liberação de microRNA não específica.

- Centrifugue o plasma dentro de uma hora para separá-lo. Certificando-se de evitar o contato com o anel linfocítico, transfira o sobrenadante para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar o sobrenadante nas mesmas condições. Alíquota de 1 mililitro deste sobrenadante de plasma em criogeniais de 1,5 milímetros, tomando cuidado para evitar coletar a fração de plasma do fundo do tubo. Para iniciar o isolamento de RNA, adicione 200 microlitros de solução OMG pré-resfriada a 200 microlitros de plasma para cada amostra. Para garantir a homogeneização completa, vórtice por 15 a 30 segundos. Para homogeneizar a amostra, adicione 200 microlitros de tampão de lise e 25 microlitros de proteinase K por amostra e vórtice por 20 segundos.

- Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius em um termomixer por 15 minutos. Em seguida, selecione o método de tecido de miRNA RSC e carregue um cartucho para cada amostra em uma bandeja de convés de um extrator automático de ácidos nucléicos, colocando corretamente o êmbolo. Transfira o lisado e adicione 5 microlitros de solução DNase 1 às posições apropriadas no cartucho do instrumento. Na base de cada tubo de eluição, adicione 60 microlitros de água livre de nuclease. Para iniciar a purificação automatizada, inicie a execução. Armazene o total de amostras de RNA a menos 80 graus Celsius.