$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Comece colocando uma seção de tecido fino em uma solução de amônia para permitir a recuperação suave do antígeno. Transfira a seção para uma lâmina revestida de polilisina. As células carregadas negativamente se ligam à polilisina carregada positivamente. Em seguida, adicione peróxido de hidrogênio para bloquear a atividade da peroxidase endógena. Lave a lâmina em solução salina com tampão Tris, TBS.
O TBS promove o acesso dos anticorpos aos antígenos, quebrando as ligações cruzadas das proteínas. Lave a seção com uma solução em bloco para reduzir a ligação de anticorpos não específicos. Adicione anticorpos primários à seção e incube durante a noite. O anticorpo primário se liga ao seu antígeno específico presente na superfície celular. Lave a lâmina com TBS.
Adicione anticorpos secundários conjugados com biotina que se ligam à região Fc do anticorpo primário. Lave a seção com a enzima estreptavidina-biotina peroxidase. Em seguida, adicione substrato cromogênico de peroxidase ao tecido. A peroxidase converte o cromogênio em um produto insolúvel colorido.
Contra-core o tecido com solução de hematoxilina. A hematoxilina se liga aos componentes ácidos das células e os torna azuis. Observe o tecido sob um microscópio de luz. Os antígenos são detectados em vermelho, enquanto as células aparecem em azul devido à hematoxilina. No protocolo a seguir, realizaremos coloração imuno-histoquímica para identificar células CD45 e CD1a a partir de biópsias endobrônquicas.
- Antes de seccionar o tecido de biópsia incorporado, ajuste cuidadosamente o porta-faca no ângulo do bloco de biópsia para que a lâmina fique plana contra a superfície do bloco. Em seguida, corte lentamente pelo menos duas seções de 2 mícrons de espessura de cada amostra de biópsia endobrônquica, usando uma pinça para transferir cada fatia de tecido recém-cortada para uma solução de amônia a 0,05% e água destilada. Após 45 a 90 segundos, use uma lâmina de microscópio revestida com poli-L-lisina para pegar cada seção desdobrada e deixe as seções secarem por pelo menos uma hora.
Quando as seções estiverem secas, rotule as lâminas conforme apropriado para o experimento e desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor de cada amostra. Em seguida, aplique 1 mililitro de solução em bloco de peroxidase recém-preparada nas seções. Após 30 minutos, remova a solução de bloqueio de peroxidase e, em seguida, lave as seções três vezes por cinco minutos com TBS, em seguida, remova o TBS e adicione uma solução de bloqueio de BSA a 1% por mais 30 minutos de incubação para bloquear qualquer ligação de anticorpo não específica.
No final da incubação, adicione o anticorpo primário de interesse, diluído em TBS, e cubra as amostras para uma incubação noturna à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, lave as lâminas três vezes em TBS e aplique o anticorpo secundário de interesse por duas horas em temperatura ambiente. No final da incubação, lavar as lâminas mais três vezes em TBS fresco e incubar as amostras em solução de complexo estreptavidina-biotina peroxidase recém-preparada por duas horas à temperatura ambiente, seguidas de mais três lavagens TBS.
Em seguida, trate os pratos com solução de substrato de peroxidase AEC recém-preparada por 20 a 30 minutos. Quando a intensidade desejada da mancha se desenvolver, enxágue as lâminas em água corrente da torneira por cinco minutos e contra-core as seções com solução filtrada de hematoxilina de Mayer. Após dois minutos, lave as lâminas em água corrente da torneira por mais cinco minutos, depois drene as lâminas e cubra as seções com meio de montagem aquoso permanente, secando as amostras em um forno de secagem a 80 graus Celsius.
Depois de esfriarem, monte as amostras com meio de montagem DPX e uma lamínula para sua análise com uma ampliação de 40 vezes em um microscópio de luz.