Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 5:08 min. • April 30th, 2023
- A terapia fotodinâmica ou PDT é um tipo de terapia de luz que utiliza fotossensibilizadores - moléculas ativadas por luzes de comprimentos de onda específicos. Um fotossensibilizador excitado converte o oxigênio molecular presente nas células em espécies reativas de oxigênio que causam a morte celular. Para iniciar o ensaio, prepare um sistema de administração de medicamentos baseado em nanopartículas desejado carregando a concentração apropriada do fotossensibilizador, sozinho ou em combinação com um medicamento de teste.
Adicione a concentração preferida desta suspensão de nanopartículas em uma cultura de células de câncer de pulmão. Incubar a cultura no escuro por um tempo apropriado para facilitar a absorção celular de nanopartículas. Substitua a suspensão pelo meio de cultura desejado. Em seguida, posicione um laser de fibra de terapia fotodinâmica acima da cultura a uma distância ideal, facilitando a iluminação uniforme. Irradie as células em um comprimento de onda apropriado pelo tempo desejado e incube durante a noite.
Substitua o meio por uma solução de medição de citotoxicidade adequada. Use um leitor de microplacas para medir a viabilidade celular e quantificar os efeitos citotóxicos do tratamento experimental. As células irradiadas contendo o fotossensibilizador apresentam viabilidade diminuída. No protocolo a seguir, realizaremos uma análise de fototoxicidade in vitro da hipocrelina B, um fotossensibilizador, e do paclitaxel, um medicamento anticâncer, encapsulado em nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida em células de câncer de pulmão A549.
- Para começar, sintetize ácido hialurônico-ceramida conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Purifique o produto usando uma membrana de diálise de 3,5 kilodalton e liofilize-o.
Em seguida, prepare as nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida sozinhas, as nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida junto com o fotossensibilizador e as nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida com um agente anticâncer e o fotossensibilizador.
Semeie a linha celular de câncer de pulmão A549 nos poços de uma placa de cultura de células de 24 poços a uma densidade de 1 vezes 10 elevado às quintas células por poço e incube as células por 24 horas. No dia seguinte, remova o meio e lave as células com 1 mililitro de PBS.
Em seguida, dissolva as nanopartículas preparadas em PBS até uma concentração final de 2 micromoles por mililitro do fotossensibilizador, hipocrelina B, por vórtice.
Em quatro poços cada, adicione 1 mililitro de PBS, 1 mililitro das nanopartículas vazias de ácido hialurônico-ceramida, 1 mililitro das nanopartículas contendo o fotossensibilizador e 1 mililitro das nanopartículas contendo o fotossensibilizador e o medicamento anticâncer.
Quando terminar, cubra a placa e incube-a a 37 graus Celsius por quatro horas no escuro para permitir a absorção de nanopartículas nas células. Em seguida, remova todas as soluções e lave as células adicionando 1 mililitro de PBS frio.
Repita a etapa de lavagem mais uma vez e, em seguida, adicione meio de cultura fresco. Em seguida, coloque a placa de cultura de 24 poços sob uma fibra de terapia fotodinâmica e posicione a fibra a 1 centímetro do primeiro poço.
- A distância da fibra da terapia fotodinâmica às células foi o fator crítico neste estudo. Era importante descobrir a distância ideal que pode cobrir toda a célula com a luz.
- Em seguida, coloque óculos de segurança e apague as luzes. Ilumine as células com o laser no escuro por entre 5 e 40 segundos para ativar oxigênio singlete altamente reativo e outros radicais livres nas nanopartículas contendo fotossensibilizadores.
Após a exposição à luz, incubar as células no escuro durante 24 horas. Em seguida, aspire o meio de cultura e lave as células com 1 mililitro de PBS frio. Repita a etapa de lavagem mais uma vez e, em seguida, adicione 100 microlitros de meio e 10 microlitros de solução de medição de citotoxicidade a cada poço.
Incube as células na solução por duas horas no escuro e, em seguida, mova todas as amostras para uma placa de 96 poços. Meça a absorbância em 450 nanômetros usando um leitor de microplacas.