Ensaio de fototoxicidade in vitro: um método baseado em PDT para avaliar o potencial fototóxico de um fotossensibilizador em células de câncer de pulmão

- A terapia fotodinâmica ou PDT é um tipo de terapia de luz que utiliza fotossensibilizadores - moléculas ativadas por luzes de comprimentos de onda específicos. Um fotossensibilizador excitado converte o oxigênio molecular presente nas células em espécies reativas de oxigênio que causam a morte celular. Para iniciar o ensaio, prepare um sistema de administração de medicamentos baseado em nanopartículas desejado carregando a concentração apropriada do fotossensibilizador, sozinho ou em combinação com um medicamento de teste.

Adicione a concentração preferida desta suspensão de nanopartículas em uma cultura de células de câncer de pulmão. Incubar a cultura no escuro por um tempo apropriado para facilitar a absorção celular de nanopartículas. Substitua a suspensão pelo meio de cultura desejado. Em seguida, posicione um laser de fibra de terapia fotodinâmica acima da cultura a uma distância ideal, facilitando a iluminação uniforme. Irradie as células em um comprimento de onda apropriado pelo tempo desejado e incube durante a noite.

Substitua o meio por uma solução de medição de citotoxicidade adequada. Use um leitor de microplacas para medir a viabilidade celular e quantificar os efeitos citotóxicos do tratamento experimental. As células irradiadas contendo o fotossensibilizador apresentam viabilidade diminuída. No protocolo a seguir, realizaremos uma análise de fototoxicidade in vitro da hipocrelina B, um fotossensibilizador, e do paclitaxel, um medicamento anticâncer, encapsulado em nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida em células de câncer de pulmão A549.

- Para começar, sintetize ácido hialurônico-ceramida conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Purifique o produto usando uma membrana de diálise de 3,5 kilodalton e liofilize-o.

Em seguida, prepare as nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida sozinhas, as nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida junto com o fotossensibilizador e as nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida com um agente anticâncer e o fotossensibilizador.

Semeie a linha celular de câncer de pulmão A549 nos poços de uma placa de cultura de células de 24 poços a uma densidade de 1 vezes 10 elevado às quintas células por poço e incube as células por 24 horas. No dia seguinte, remova o meio e lave as células com 1 mililitro de PBS.

Em seguida, dissolva as nanopartículas preparadas em PBS até uma concentração final de 2 micromoles por mililitro do fotossensibilizador, hipocrelina B, por vórtice.

Em quatro poços cada, adicione 1 mililitro de PBS, 1 mililitro das nanopartículas vazias de ácido hialurônico-ceramida, 1 mililitro das nanopartículas contendo o fotossensibilizador e 1 mililitro das nanopartículas contendo o fotossensibilizador e o medicamento anticâncer.

Quando terminar, cubra a placa e incube-a a 37 graus Celsius por quatro horas no escuro para permitir a absorção de nanopartículas nas células. Em seguida, remova todas as soluções e lave as células adicionando 1 mililitro de PBS frio.

Repita a etapa de lavagem mais uma vez e, em seguida, adicione meio de cultura fresco. Em seguida, coloque a placa de cultura de 24 poços sob uma fibra de terapia fotodinâmica e posicione a fibra a 1 centímetro do primeiro poço.

- A distância da fibra da terapia fotodinâmica às células foi o fator crítico neste estudo. Era importante descobrir a distância ideal que pode cobrir toda a célula com a luz.

- Em seguida, coloque óculos de segurança e apague as luzes. Ilumine as células com o laser no escuro por entre 5 e 40 segundos para ativar oxigênio singlete altamente reativo e outros radicais livres nas nanopartículas contendo fotossensibilizadores.

Após a exposição à luz, incubar as células no escuro durante 24 horas. Em seguida, aspire o meio de cultura e lave as células com 1 mililitro de PBS frio. Repita a etapa de lavagem mais uma vez e, em seguida, adicione 100 microlitros de meio e 10 microlitros de solução de medição de citotoxicidade a cada poço.

Incube as células na solução por duas horas no escuro e, em seguida, mova todas as amostras para uma placa de 96 poços. Meça a absorbância em 450 nanômetros usando um leitor de microplacas.

• Phototoxicity assay – A test used to measure the toxicity of light-activated substances on cells.
• Photosensitizer – Molecules activated by specific light wavelengths.
• Phototoxicity – The toxic effects elicited by light exposure on certain substances.
• Photodynamic therapy (PDT) – Light therapy utilizing photosensitizer for treatment.
• PDT test – Testing method that measures photodynamic therapy effectiveness.

• Introduce Photodynamic Therapy – A light therapy utilizing photosensitizers (e.g., PDT test).
• OutlinePhototoxicity Assay – A test for assessing light-activated substance toxicity (e.g., photosensitizer).
• Underlying Mechanisms – The photosensitizer's transformation into reactive oxygen species (e.g., phototoxicity).
• Connect to Experiment – The assay measures cytotoxic effects of photodynamic therapy on lung cancer cells.

• What is photodynamic therapy and how does it use a photosensitizer?
• How does a phototoxicity assay evaluate light-activated substances?
• How does phototoxicity influence the photodynamic therapy process?

• Practical Applications – PDT test applied in lung cancer treatments (e.g., photodynamic therapy lung cancer).
• Industry Impact – The increased potential in cancer treatment (e.g., healthcare).
• Societal Importance – Broader potential benefits in tackling prevalent diseases(e.g., cancer treatment).
• Link to Scientific Advancements – Reinforces understanding of light-based therapies and their effects.