Isolamento de exossomos: uma técnica para separar exossomos do plasma de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas
JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 4:21 min • April 30th, 2023
- Os exossomos são pequenas vesículas ligadas à membrana que transportam biomoléculas como lipídios, proteínas, DNA, mRNA e microRNA. Os exossomos são liberados por diferentes tipos de células em espaços extracelulares e podem ser isolados de biofluidos como o plasma.
Para começar, centrifugue a amostra de plasma para remover células e detritos. Transferir o sobrenadante plasmático para um novo tubo. Trate o plasma com a concentração desejada da enzima ribonuclease. Incubar a amostra num bloco de aquecimento a 37 graus Celsius durante um período adequado.
A enzima degrada qualquer RNA livre na amostra, enquanto o RNA exossômico permanece protegido. Diluir a amostra com PBS. Em seguida, adicione a concentração desejada de solução enzimática de proteinase K e incube a 37 graus Celsius por um tempo apropriado. A proteinase K degrada a maior parte das proteínas plasmáticas. Também inativa a enzima ribonuclease adicionada anteriormente, eliminando assim o risco de degradação do RNA exossômico durante o processamento a jusante.
Adicionar um volume adequado de tampão de precipitação de exossomas para facilitar a separação dos exossomas do plasma. Centrifugar a amostra para obter um sedimento contendo exossomas intactos. Os exossomos isolados encontram aplicações em etapas a jusante, como extrações de RNA e proteínas.
No protocolo a seguir, realizaremos o isolamento de exossomos da amostra de plasma de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.
- Para começar, descongele uma amostra de plasma de 1 mililitro no gelo. Depois de descongelado, inverta o tubo várias vezes para desagregar quaisquer crioprecipitados que possam ter se formado. Em seguida, centrifugue o plasma a 2.000 Gs por 20 minutos em temperatura ambiente, a fim de remover células e detritos. Colete o sobrenadante e centrifugue o plasma novamente, agora a 10.000 Gs por 20 minutos. Novamente, colete o sobrenadante de plasma e agora adicione 10 microlitros de RNAse. Incube o plasma a 37 graus Celsius por 10 minutos em um aquecedor de bloco térmico.
- Adicionamos uma etapa de tratamento de RNAse ao protocolo do kit padrão para degradar os microRNAs livres. Posteriormente, a etapa de tratamento com proteinase K, incluída no protocolo do kit, foi explorada com o objetivo de degradar a RNAse e proteger a integridade dos microRNAs exossômicos.
- Em seguida, transfira o plasma para um novo tubo com metade do volume de 1x PBS e faça um vórtice. Em seguida, adicione 0,05 volumes de solução de proteinase K, vortex a amostra novamente e incube-a a 37 graus Celsius por 10 minutos. Agora, adicione 0,2 volumes de tampão de precipitação de exossomos e misture a amostra por inversão. Em seguida, incube a amostra a quatro graus Celsius por 30 minutos.
Após a incubação a frio, centrifugue a amostra a 10.000 Gs por cinco minutos em temperatura ambiente. Pegue uma alíquota de 20 a 50 microlitros do sobrenadante e guarde-a para fins de controle. Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante restante.
Ressuspender o sedimento de exossoma no tampão da sua escolha, a um volume que depende da análise a jusante. Para análise de RNA, adicione tampão de lise específico para extração de RNA.
Visão Geral
Este artigo discute o isolamento de exossomos de amostras de plasma, especificamente de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Exossomos são vesículas pequenas que carregam diversas biomoléculas e desempenham um papel significativo na comunicação intercelular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Oncologia
Contexto
- Os exossomos são vesículas delimitadas por membrana liberadas pelas células.
- Contêm lipídios, proteínas, DNA, mRNA e microRNA.
- Os exossomos podem ser isolados de fluidos biológicos como o plasma.
- As técnicas de isolamento são fundamentais para o estudo do conteúdo exossomal.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o isolamento de exossomos do plasma.
- Aprimorar a compreensão da integridade do RNA exossomal durante o processamento.
- Facilitar aplicações posteriores, como extração de RNA e proteínas.
Métodos Utilizados
- Centrifugação do plasma para remover células e detritos.
- Tratamento com ribonuclease para degradar o RNA livre.
- Uso da Proteinase K para proteger o RNA exossomal.
- Precipitação e isolamento de exossomos por meio de centrifugação.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de exossomos intactos de amostras de plasma.
- Proteção da integridade do RNA exossomal durante o processamento.
- O protocolo permite análises eficazes em etapas subsequentes.
Conclusões
- O protocolo descrito é eficaz para o isolamento de exossomos.
- Ele aumenta a confiabilidade dos estudos de RNA exossomal.
- São possíveis aplicações adicionais na pesquisa de câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento confiável de exossomos a partir do plasma permite o acesso não invasivo a biomarcadores moleculares, apoiando a detecção precoce e o monitoramento longitudinal na pesquisa oncológica. Este fluxo de trabalho aumenta a confiança preditiva na descoberta de biomarcadores e em estudos translacionais, preservando a integridade do RNA e das proteínas exossomais. O método posiciona a biópsia líquida baseada em exossomos como uma ferramenta escalonável para a validação abrangente de biomarcadores e o rastreamento da progressão da doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a análise de RNA e proteínas exossomais circulantes para validação de alvos.
- Contribui para a desmistificação biológica ao isolar vesículas relevantes para a doença a partir do plasma de pacientes.
- Facilita a confiança preditiva na identificação de biomarcadores para pipelines oncológicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece preparações padronizadas de exossomos para ensaios moleculares subsequentes.
- Garante reprodutibilidade e consistência quantitativa na extração de RNA e proteínas exossomais.
- Prepara amostras adequadas para triagem em alta escala de candidatos a biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir amostragens seriadas de pacientes.
- Mantém a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica de biomarcadores derivados de exossomos.
- Reduz o risco no avanço de biomarcadores candidatos para avaliação clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de isolamento de exossomos integra-se na interface entre biologia da descoberta e pesquisa translacional, apoiando fluxos de trabalho desde a identificação precoce de biomarcadores até a validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Permite o teste de hipóteses sobre o conteúdo exossomal como indicador de doenças.
- Triagem: Fornece amostras reprodutíveis de exossomos para o desenvolvimento e validação de ensaios.
- Análises: Permite a medição quantitativa de RNA e proteínas exossomais para estudos comparativos.
- Pesquisa Translacional: Facilita a correlação entre marcadores de biópsia líquida e modelos de progressão da doença.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: Estabelece um protocolo reutilizável para o isolamento de exossomos em diversas áreas de doenças e estudos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na descoberta de biomarcadores e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento de exossomos para fluxos de trabalho reprodutíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao permitir análises robustas e não invasivas de biomarcadores.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos a biomarcadores para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de plasma e na biologia de exossomos.
- Requer acesso a equipamentos de centrifugação e infraestrutura para análise molecular.
- Exige padronização entre equipes para o processamento de amostras e interpretação de dados.
- Adaptável a diversos volumes de plasma e requisitos analíticos posteriores.
- Depende de tratamento enzimático cuidadoso para preservar a integridade do RNA exossomal.
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Última atualização: 29 agosto 2026