FISH de DNA 3D: uma técnica para localizar um gene específico em um cromossomo

- Pegue um fio funcionalizado com células presas em sua superfície e coradas por coloração de imunofluorescência. Lave-o com uma solução salina gelada de citrato de sódio ou SSC. Coloque o fio em um microtubo contendo sondas marcadas com fluorescência e feche-o com uma rolha de arame. Incube o microtubo em uma câmara escura e úmida em um forno de hibridização a 75 graus Celsius para desnaturar o DNA dentro das células.

Transfira a câmara para um forno a 37 graus Celsius para que as sondas se liguem à sequência complementar no DNA. Em seguida, retire a câmara do forno e retire o fio. Mergulhe o fio em um tubo contendo solução SSC na temperatura desejada. Lave o fio com a solução SSC contendo Tween para remover sondas não específicas ou parcialmente hibridizadas e lave novamente em água destilada.

Seque o fio e incube a ponta funcionalizada em solução DAPI para corar os núcleos da célula. Enxágue o fio em PBS e seque ao ar. Coloque o fio sob um microscópio de fluorescência. A sonda hibridizada com o gene de interesse aparece como uma mancha fluorescente nos núcleos da célula. No protocolo a seguir, realizaremos FISH de DNA 3D para determinar a translocação do gene ALK em células de c