Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 4:17 min. • April 30th, 2023
- Primeiro, coloque uma fatia de tecido em um papel de filtro embebido em PBS para evitar o encolhimento ou inchaço das células, equilibrando a osmolaridade. Transfira o tecido para um histo. Feche e coloque o em formalina tamponada neutra, solução NBF. O NBF contém formaldeído que se liga a grupos amino de aminoácidos e previne a formação de ácido fórmico que pigmenta o tecido. Deixe o durante a noite a uma temperatura baixa, o que evita a degradação do ácido nucleico e fixa o tecido. Desidrate o tecido com várias lavagens de álcool.
Coloque-o em parafina líquida e pressione-o até o fundo do molde. Remova o peso e coloque a parte inferior do histo no tecido. Despeje parafina líquida no conjunto. Deixe a configuração solidificar em uma placa fria. A parafina é insolúvel em água e, após entrar no tecido desidratado, endurece e ajuda no seccionamento. Transfira o bloco de tecido em um micrótomo. Corte e colete seções finas do tecido em uma lâmina. Se a seção for muito espessa, o oxigênio e outros nutrientes não podem se difundir pela fatia, criando um falso gradiente de necrose. Se a seção for muito fina, ela tende a enrolar. O vídeo do protocolo examina a expressão de biomarcadores e a viabilidade celular de tecidos FFPE de câncer de pulmão.
- Para começar a fixar a fatia desejada, transfira-a cuidadosamente usando uma pinça para uma placa de 10 centímetros contendo um papel de filtro embebido em 2 a 3 mililitros de PBS e deixe-o flutuar. Em seguida, retire o papel de filtro com uma pinça e coloque-o em um histo. Transfira o papel de filtro para um de histo. Adicione uma gota de hematoxilina diluída em cima da fatia de tecido para marcar a posição da fatia para as etapas subsequentes. Feche o e transfira-o para uma solução de formalina tamponada neutra a 4% e deixe durante a noite a 4 graus Celsius. Após a lavagem e processamento do conforme descrito no protocolo, abra o histo e use um bisturi para levantar cuidadosamente a fatia fixa do papel de filtro. Descarte o papel de filtro e transfira a fatia para um molde contendo parafina líquida.
Use um peso plano para pressionar o tecido contra a parte inferior do molde de incorporação para garantir um corte uniforme. Coloque a parte inferior do histo em cima do molde, adicione parafina líquida por cima e deixe o molde esfriar em uma placa fria por 30 minutos. Depois disso, separe o molde resfriado do bloco de parafina. Use um micrótomo para preparar seções finas de 4 micrômetros dos blocos de fatia de tecido FFPE. Apare o excesso de parafina ao redor do tecido. Para obter seções uniformes em todo o tecido, ajuste o ângulo do bloco para que a superfície do bloco seja orientada horizontalmente em relação à lâmina. Usando um pincel fino, colete seções de tecido sequenciais da fatia de tecido embebido em parafina começando na parte superior das lâminas de vidro. Continue coletando as seções das camadas de tecido mais profundas para o meio, seguidas pela parte inferior das lâminas de vidro.
- A coleta de seções de diferentes camadas de cada fatia de tecido para as lâminas do objeto é feita para permitir a captura de gradientes induzidos por cultura em potencial na viabilidade, migração celular ou expressão de biomarcadores.
- Após a coleta das seções, continue com seu processamento e análise posterior conforme descrito no protocolo.