Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis

O objetivo geral deste procedimento é estudar a conservação evolutiva da proteína de choque térmico G 96 em promover respostas de células T CD8 específicas para antígenos no sapo Xenopus laevis. Isso é realizado primeiramente colhendo leucócitos peritoneais por meio de lavagem peritoneal. O segundo passo do procedimento consiste em pulsar os leucócitos peritoneais com GP 96 derivada de tumor, que atua como coadjuvante de antígenos menores e tumorais, após incubação e lavagens.

Os leucócitos peritoneais são transferidos adotivamente por injeção intraperitoneal para sapos ingênuos com o objetivo de sensibilizar esses animais contra antígenos tumorais ou de histocompatibilidade menor. O terceiro passo do procedimento consiste em realizar um enxerto de pele ou desafiar os sapos sensibilizados com tumor, monitorando o aparecimento do enxerto de pele, rejeição ou desenvolvimento tumoral. O passo final do procedimento é obter sangue periférico para caracterizar os linfócitos T envolvidos nas respostas de rejeição de pele e anti-tumorais.

No final, podem ser obtidos resultados que mostram uma aceleração significativa na rejeição de enxertos de pele, bem como atrasos no aparecimento de tumores em sapos previamente sensibilizados com GP 96, por meio dos ensaios de enxerto de pele e desafio tumoral, respectivamente. Olá, sou Christina Koska no laboratório da Dra. Jacque Robert do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Centro Médico da Universidade de Rochester. Sou Tanya Cruz, também do laboratório da Dra. River.

Hoje vamos mostrar um procedimento para sensibilizar rãs clonadas por meio da transferência adotiva de leucócitos peritoneais, seguido por ensaios de enxerto de pele e transplante de tumor. Além disso, também mostraremos como obter sangue periférico desses animais. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a capacidade da proteína de choque térmico GP96 de promover células CDAT específicas para antígenos em Salla, bem como para investigar os tipos celulares envolvidos.

Ok, vamos começar. Os sapos utilizados em nossos experimentos são clones genéticos ISO provenientes da nossa colônia de reprodução na Universidade de Rochester. Para estimular os leucócitos peritoneais ou pls para coleta, utilize uma agulha de 25 gauge cinco oitavos para injetar o sapo anestesiado por via intraperitoneal com uma preparação de e. coli morta pelo calor. Três dias após a injeção, os pls são coletados por lavagem intraperitoneal.

Para iniciar este procedimento, desinfete o abdômen do sapo anestesiado com uma pequena quantidade de etanol 70%. Em seguida, utilize uma agulha 18 gauge 1,5 para injetar cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril para anfíbios, ou PBS pré-aquecido à temperatura ambiente, na cavidade peritoneal. Retire a agulha e massageie suavemente o sapo por um minuto para garantir que o tampão injetado se equilibre com o fluido na cavidade corporal.

Em seguida, insira uma nova agulha 18 gauge de 1,5 polegadas sem seringa no abdômen do sapo. Enquanto evita os vasos sanguíneos, colete o líquido peritoneal que escorrerá pela parte traseira da agulha para um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Certifique-se de recuperar o maior volume possível do líquido injetado inicialmente após a coleta dos pls.

Coloque o sapo em um recipiente com água rasa até que ele acorde, momento em que poderá ser devolvido à sua gaiola. Após a coleta dos pls, centrifugue a 1000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante e ressuspenda. Suspenda os pls em PBS A frio.

Transfira o pls RESSUSPENSO para um tubo microfúgico de 1,5 mililitro. Para pulsar o PLS com GP 96, adicione a quantidade apropriada de GP 96 ao pls e misture por pipetagem. Incube no gelo durante uma hora após uma hora.

Centrifugue as células a 14.000 RPM durante um minuto. Para remover qualquer GP 96 não ligado, remova o sobrenadante. Adicione PBS A frio e ressuspenda.

Suspenda novamente o PLS em centrífuga. Lave o S com A-P-B-S-A frio um total de três vezes para garantir que não reste G 96 residual após a lavagem final. Resuspenda os PLS pulsados em uma concentração de cinco vezes 10 à quinta potência de PLS por 300 microlitros de PBS para transferir adotivamente os PLS para seis receptores LG ingênuos.

Injecte intraperitonealmente 300 microlitros de pls pulsado por animal. Os sapos precisam ser sensibilizados pelo menos três dias antes dos experimentos de enxerto de pele ou desafio com tumor, que serão mostrados a seguir. A pele para enxerto é obtida de um sapo doador LG 15 anestesiado.

Use uma tesoura para cortar e remover um pequeno pedaço de pele ventral, que é a pele abdominal com aparência prateada. Devido à presença de quatro células pigmentadas do ARI ao manipular o enxerto. É fundamental manipular o tecido o mínimo possível, pois isso causará danos ao enxerto.

Segure a pele muito suavemente com a pinça e coloque-a em uma placa de Petri contendo PBS A frio. Mantenha a placa de Petri sobre a superfície. Coloque a pele em uma lâmina de vidro limpa e use uma lâmina de barbear para cortar enxertos individuais em pedaços de cinco milímetros por cinco milímetros.

Mantenha os fragmentos em PBS sobre gelo para enxertar a pele no sexto sapo receptor da LG. Primeiro, faça uma pequena incisão na pele dorsal do receptor anestesiado. Em seguida, insira o enxerto de cinco milímetros por cinco milímetros sob a pele com o lado prateado voltado para cima.

Certifique-se de observar as marcações de tesoura e pinça nos enxertos, pois essas não são consideradas rejeição do enxerto. Assim que a pontuação começar 24 horas depois, uma parte da pele do hospedeiro sobreposta precisa ser removida do enxerto. Use uma tesoura para recortar uma janela ao redor do enxerto, de modo que o enxerto possa ser visualizado livremente.

Tenha cuidado para não tocar a pele do doador nem provocar sangramento. Comece a escorear o enxerto imediatamente fazendo um esboço. Enxerto de pele.

A rejeição é determinada pela porcentagem de destruição do aridol na pele enxertada. O enxerto deve ser verificado a cada dois ou três dias sob o microscópio estereoscópico. Prepare as células tumorais para transplante por ressuspendência, suspendendo-as no meio de cultura tumoral numa densidade de cinco vezes 10 à quinta células por 300 microlitros.

Transplante as células por injeção subcutânea em um dos lados da região dorsal do animal. Cinco vezes 10 elevado a cinco células em um volume de 300 microlitros são injetadas por rã. O crescimento tumoral iniciará dentro de duas a três semanas após o desafio com o tumor.

Observe a aparência inicial do tumor. Use paquímetros para medir as dimensões do tumor e registre seu volume a cada dois ou três dias antes da coleta de leucócitos sanguíneos do sapo. Prepare agulhas de vidro puxando pontas de pipeta sobre uma chama.

Após afiar a extremidade fina da pipeta sob o microscópio estereoscópico, conecte a pipeta a um tubo plástico de aspiração. Para iniciar a coleta de sangue, corte a pele acima do pé posterior do sapo anestesiado para expor a veia do tarso dorsal. Encha a agulha de vidro com um a dois mililitros de solução de PBS A frio acrescida de heparina.

Em seguida, insira a agulha de vidro na veia e comece a coletar o sangue aspirando lentamente com a boca. Pode-se obter de um a dois mililitros de sangue de um sapo de tamanho médio. O pequeno corte na perna do sapo não precisa ser costurado.

A ferida cicatrizará dentro de uma semana. Aqui são apresentados os resultados de uma análise por microscopia estereoscópica da rejeição de enxerto de pele 12 dias após o transplante. Um sapo LG seis clonado que recebeu um enxerto de pele de um doador LG seis com MHC idêntico não apresentou rejeição.

O asterisco indica a pinça marcadora não relacionada à rejeição. Em contraste, um sapo clonado LG seis que recebeu um enxerto de pele de um doador não endogâmico com MHC distinto apresenta 80% de rejeição. Em ambas as imagens, as setas indicam células pigmentadas iridescentes prateadas que marcam o tecido enxertado saudável e não rejeitado.

No próximo experimento, plaquetas linfocíticas do grupo 15 (LG 15) foram estimuladas com PBS como controle negativo, GP 96 recombinante purificado de um cultivo de *E. coli* ou GP 96 purificado de células de tecido tumoral do grupo 15 zero. Em seguida, essas plaquetas foram transferidas adotivamente para receptores adultos do grupo 15, e três dias depois células tumorais vivas do grupo 15 zero foram transplantadas por injeção subcutânea. Os tumores que surgiram após o desafio foram monitorados e o tamanho dos tumores foi medido periodicamente. Nestes gráficos, cada curva representa a cinética do crescimento tumoral em um sapo. Os resultados mostram que os animais previamente sensibilizados com 0,5 ou um micrograma de GP 96 apresentaram um atraso significativo no aparecimento do tumor em comparação com os grupos-controle. Portanto, GP 96 facilita a apresentação cruzada de antígenos tumorais em *Xenopus*.

Portanto, acabamos de mostrar como explorar a capacidade da GP96 de representar antígenos menores e tumorais na rã Xenopus laevis por meio de ensaios de enxerto de pele e transplante de tumor. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de evitar a coleta da lavagem peritoneal se um vaso sanguíneo tiver sido danificado, já que a maioria das células será de eritrócitos e não de macrófagos. Também é importante evitar comprimir o tecido com a pinça ao manipular o enxerto de pele, a fim de evitar danos.

É isso aí. Obrigado por lavar e boa sorte com seus experimentos.