Name: Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a investigar a proteína gp96 em respostas imunes de células T CD8 usando Xenopus laevis. Este método permite estudar a apresentação cruzada de antígenos tumorais e cutâneos em modelo não mamífero.

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A criação de animais técnicos fornecidos pela Tina Martin e David Albright é apreciadas. Esta pesquisa foi suportada por concessões T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 do NIH.

1. Animais X. laevis x X. Gilli híbridos LG-6 e LG-15 isogenetic clones 1 são da nossa colônia de reprodução da Universidade de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 compartilham o mesmo haplótipo heterozigoto MHC (a / c), mas diferem em menores de histocompatibilidade (H) loci. Progênie desses clones são produzidos por gynogenesis, em que os ovos diplóides produzido pela fêmea são ativados por UV-irradiados esperma (não há contribuição de DNA para os descendentes). O uso de luvas é facultativa. Algumas pessoas preferem não usá-los porque é mais difícil lidar com as rãs (escorregadio) e de fato parece fazer as rãs desconfortável. 2. Purificação da gp96 de 15 / 0 Tumor (expressa tanto Tumor e Menores H-Ags) Gp96 purificação foi descrito anteriormente 2, 3. Resumidamente, gp96 é purificada por fracionamento 50-70% sulfato de amônio, seguido de ConA-Sepharose e cromatografia DEAE. Cerca de 20-50 mg de proteína pode ser obtida por 1 mL de tecido do tumor. Pureza da preparação é determinado por SDS-PAGE e coloração lasca. 3. Elicitação e Colheita de Leucócitos Peritoneal (PLs) de Minor H-Ag-díspares LG-6 Frogs <ol><li> Crescer uma noite para o dia 25 mL E. Cultura coli em um tubo de 50 ml a 37 ° C com agitação. </li><li> O calor dia seguinte matar as bactérias pela fervura por 1 hora. </li><li> Centrifugar o calor matou E. Coli por 15 min a 2.000 rpm (1.500 g) a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de bactérias em 1 / 10 º volume da cultura original (2,5 mL) em APBS. Neste ponto, a cultura bacteriana está pronto para uso e deve ser usado dentro de 24 horas. </li><li> Injetar por via intraperitoneal (ip) 200 (para um sapo 2 polegada) ou 300 mL (para um sapo de 3 polegadas) da preparação de calor matou bacteriana por sapo usando um calibre 25 08/05 agulha. </li><li> Três dias após a injeção PLs são colhidas por lavagem intraperitoneal. </li><li> Antes da colheita PL, sapos adultos são anestesiados por imersão em uma solução aquosa de 0,1% tricaina sulfonato metano (TMS, MS-222) tamponada com bicarbonato de sódio para até 5 min até que todo o movimento cessa (duração depende do tamanho e idade). Animais acordar dentro de 10-20 min após o tratamento. </li><li> Desinfectar o abdômen do sapo com uma pequena quantidade de etanol a 70%. </li><li> Injetar 5 mL (para um sapo 2 polegadas) ou 10 mL (para um sapo de 3 polegadas) de APBS estéril pré-aquecido em temperatura ambiente para a cavidade peritoneal através de um calibre 18 1 ½ agulha. Remova a agulha e massagear suavemente o sapo por um minuto para assegurar que o buffer injetado equilibra com o líquido na cavidade do corpo. </li><li> Use um medidor de 18 novos 1 ½ agulha sem uma seringa para coletar o líquido peritoneal que vai pingar na parte de trás da agulha em um tubo limpo de 50 mL cônico. Certifique-se de recuperar o máximo de volume inicial injetado possível. Ter cuidado para evitar os vasos sanguíneos na área central da região abdominal. </li><li> Uma vez que PLs são colhidas colocar o sapo em um recipiente com água rasa até que seja acordado em que ponto ele pode ser colocado de volta em sua gaiola. </li></ol> 4. Transferência pulsante e adotiva do Lg-6 Pls Em Naive Lg-6 Destinatários <ol><li> Lavar os PLs uma vez com APBS frio e centrifugar-los a 1.000 rpm (750 g) por 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o PLs em APBS. </li><li> O pulso do PL com gp96 em uma concentração de 1 mg gp96 por 5 x 10 5 PLs. </li><li> Uma vez que a quantidade adequada de gp96 é adicionado ao PLS, misturá-los por pipetagem e incubar no gelo por 1 hora. </li><li> Centrifugar as células ou a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C ou menos 14.000 rpm por 1 min para remover qualquer unbound gp96. </li><li> Lavar os PLs 3X com APBS fria para garantir que não haja deixado gp96 residual. </li><li> Ressuspender o PLs pulsado a uma concentração de 5 x 10 5 PLs por 300 mL. </li><li> Adotivamente transferência PLs por injeção ip usando calibre 25 08/05 agulha. Injetar 300 mL de PLs pulsado (5 x 10 5 células) por animal. </li><li> Rãs precisam ser preparadas pelo menos três dias antes de continuar com enxerto de pele ou experiências desafio tumor. </li></ol> 5. Ensaio de enxerto de pele Rejeição do enxerto de pele é um ensaio bem estabelecido em Xenopus 4, 5, 6. Em Xenopus, um destinatário rejeita a pele do doador exibir 1 ou 2 desencontros haplotipo MHC dentro de 18-22 dias a 21-22 ° C. Em contraste, enxertos de pele entre a LG ea LG-6-15 clones que diferem apenas por menores H-Ags são rejeitados mais lentamente (mais que 30 dias). No entanto, essa rejeição é acelerado em receptores that foram imunizadas contra doadores menores H-Ags quer por um enxerto de pele anterior ou pela imunização com gp96 purificada do doador. Sem rejeição em todos ocorre quando o dador eo receptor são geneticamente idênticos (por exemplo, animais clonados ou totalmente puras). Portanto, esta técnica simples é muito poderosa para a caracterização in vivo respostas imunes induzidas pela gp96. <ol><li> Anestesiar sapo doador, conforme descrito em 3.7. Nota: Apenas as precauções mínimas precisam ser tomadas desde Xenopus produzir potente anti-microbial peptídeos (por exemplo, magainin) na pele que elimina a necessidade para o total de procedimentos assépticos. Na verdade, o tratamento do sapo com qualquer desinfetante seria prejudicial para a pele. Além disso, Xenopus não têm qualquer patógenos que podem ser transferidos para os seres humanos. Portanto, o uso de luvas é opcional. No entanto, todos os instrumentos usados ​​dissecção precisa ser autoclavados e todas as soluções precisam ser esterilizados. </li><li> Corte e retire uma pequena (20 mm X 5 mm) pedaço de pele ventral (pele abdominal que aparece prateado, devido à presença de irridophore células pigmentadas) de um sapo doador LG-15 com uma tesoura. </li><li> Coloque a pele em uma APBS petridish contendo e mantê-lo no gelo. Manipular o tecido da pele muito gentilmente, evite segurá-lo entre fórceps. </li><li> Usando uma navalha ou tesoura corte enxertos individuais em 5 mm X 5 peças mm. Manter os fragmentos em APBS no gelo. </li><li> Neste ponto, o sapo doador é colocado em um recipiente com água rasa até que seja acordado e, em seguida, ele é colocado em água contendo antibióticos (Penstrep na concentração de 5 mg / L). O sapo é mantido em água com antibióticos durante dois dias em que ponto ele é devolvido em água normal. A pequena ferida no local onde a pele foi removida não precisa ser costurada e cura em uma semana. </li><li> Anestesiar o destinatário sapo LG-6. </li><li> Fazer uma pequena incisão na pele (costas) dorsal do destinatário e insira os 5 mm X 5 mm de enxerto sob a pele com o lado prateado para cima. Tenha cuidado para não introduzir grandes bolhas de ar sob a pele, porque isso pode levar ao deslocamento ou mesmo perda do enxerto. </li><li> Certifique-se de observar as marcações tesoura e uma pinça na enxertos porque aqueles não são contados como rejeição do enxerto, uma vez o placar começa. </li><li> 24 horas mais tarde uma parte da pele do hospedeiro sobrepondo precisa ser removido do enxerto. </li><li> Anestesiar o destinatário sapo LG-6. Lidar com o animal, como descrito em 5.1. </li><li> Com uma tesoura esterilizada cortar uma janela ao redor do enxerto, para que o enxerto pode ser livremente visualizado. Tenha cuidado para não tocar a pele do doador ou para induzir o sangramento. Vamos recuperar o sapo como descrito em 5.5. </li><li> Começar a marcar o enxerto de imediato, tomando um esboço. Rejeição do enxerto de pele é determinada pela porcentagem de destruição da irridophores na pele enxertada. </li><li> Os enxertos precisam ser verificados a cada 2-3 dias, mas os animais não precisam de ser anestesiado para isso. Para visualizar os enxertos, os sapos precisam ser colocados em um petridish sob um microscópio de dissecação. </li></ol> 6. Toda montagem de imuno-histologia pele transplantada Sapo todo-mount imuno-histologia foi descrita anteriormente 6. Resumidamente, o sapo é anestesiado e colocado sob o microscópio em uma toalha de papel estéreis pré-molhada com água sapo (a área de trabalho também é preparado em condições assépticas). A pele transplantada é então retirada junto com uma pequena quantidade de pele circundante do host e é corado com anticorpos semelhante à coloração de células para análise de citometria de fluxo 6. Instrumentos autoclavados e buffers estéreis devem ser usados. Após a coloração da pele é colocada sobre uma lâmina de microscópio e delicadamente pressionado com uma lamínula. Neste ponto, a pele pode ser visualizado utilizando um microscópio de fluorescência para diferentes populações de células que se infiltraram o enxerto. Após o procedimento o sapo é mantido em água com antibióticos, como descrito na seção 5.5. e voltou em água normal. A pequena ferida esquerda, onde a pele foi removida cicatriza em uma semana. 7. Caracterização de leucócitos do sangue <ol><li> Antes de remover o sangue do sapo, é preciso preparar "agulhas de vidro" puxando pipetas Pasteur estéreis sobre chama. A extremidade fina da pipeta está afiada sob o estereomicroscópio. A pipeta é então ligado a um tubo de plástico aspiração. Todos os instrumentos, como a pinça e tesouras precisa ser autoclavados antes do uso. </li><li> Também preparar 10 mL de gelo frio do APBS e solução de heparina pela adição de 50 unidades de heparina por 1 mL de APBS. Mantenha a solução em gelo. Todas as soluções utilizadas devem ser estéreis. </li><li> Anestesiar sapo como descrito em 3.7, e seguir os procedimentos mesmo animal manuseio, como descrito em 5.1. . </li><li> Cortar a pele acima do pé posterior para expora veia dorsal do tarso. </li><li> Encher a pipeta Pasteur com 1-2 mL de solução APBS + heparina. </li><li> Insira o "agulha de vidro" na veia e começar a recolher o sangue lentamente por aspiração com a boca. É importante ter solução + APBS heparina na "agulha de vidro", pois isso vai impedir a coagulação do sangue e entupimento da ponta da agulha. </li><li> 1-2 mL de sangue podem ser obtidas a partir de um sapo de tamanho médio. </li><li> A pequena incisão na perna do sapo não precisa ser costurada ea ferida cicatriza em uma semana. </li><li> Centrifugar o sangue a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar as células 1X com 10 mL de APBS frio. </li><li> Sobreposição de 2 mL de sangue (1-5 x 10 6 células) em 1 mL de Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) pré-aquecido em temperatura ambiente, a fim de separar os leucócitos do sangue a partir de células vermelhas do sangue. </li><li> Centrifugar 20 min a 1.000 rpm em temperatura ambiente, sem freio, e depois recolher a banda de leucócitos. </li><li> Lavar as células com 2X APBS por centrifugação a 1.400 rpm por 10 min a 4 ° C para remover o Ficoll residual. </li><li> Neste ponto as células estão prontas para serem coradas com anticorpos para a análise de citometria de fluxo, ou para ser usado para ensaios em cultura in vitro. </li></ol> 8. Ensaio de Transplante de tumor <ol><li> Cerca de uma semana antes do degelo experimentar um novo lote de 15 / 0 células tumorais e certifique-se que as células começam a crescer também. Meio de cultura é descrito sucintamente na próxima seção e com mais detalhes em 3. </li><li> Expandir as células 15 / 0 tumor. </li><li> No dia do experimento, a contagem de células e determinar a morte celular por exclusão do azul Trypan. Morte celular deve ser inferior a 5%. Lave as células em 1X APBS frio, e centrifugar a 1.000 rpm a 4 ° C por 10 min. </li><li> Ressuspender as células em meio de cultura tumor com uma densidade de 5 x 10 5 15 / 0 células por 300 ml. </li><li> Transplante de 5 x 10 5 células em 300 mL de volume por rã por injeção subcutânea utilizando um calibre 25 08/05 agulha em um lado do lado (back) dorsal do animal. </li><li> O crescimento do tumor vai começar dentro de 2-3 semanas após o desafio tumor. O aparecimento do tumor inicial deve ser observado e que o volume do tumor deve ser registrada a cada 2-3 dias. Volume tumoral (altura, comprimento X largura X) é medido com paquímetro. </li><li> Uma vez que o tumor cresce a 3.500 mm 3 ou o sapo começa a olhar letárgico, ele precisa ser sacrificado para evitar desconforto. </li></ol> 9. Reagentes necessários: <ul><li> Anfíbios Tampão fosfato salino (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4, 0,2 g / L KH 2 PO. pH para 7,5 utilizando NaOH 10N e filtro esterilizado 0,2 m através do filtro. </li><li> Tricaina Sulfonato de Metano (TMS, MS-222) (Crescent Pesquisa Química CAS # 886-86-2). </li><li> Bicarbonato de sódio (Fisher Scientific-S 233-500). </li><li> Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 mL) </li><li> Heparina sal de sódio (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Meio de cultura para Xenopus 15 / 0 tumores [ver 3 para mais detalhes]: 1 L de meio DMEM Iscove basal (Gibco-Invitrogen 11965) com 10 mL de insulina, 10 mL não-aminoácidos essenciais, 10 mL de penicilina-estreptomicina, 10 mg / mL de canamicina, 3 mL de primatone (Sheffield Divisão de Produtos), 1 mL de β2-mercaptoetanol, e 3,02 g NaHCO 3 em água (pH 7,0). Este meio é diluído para osmolaridade anfíbios, adicionando 30% de água bidestilada, e suplementada com 5% de soro fetal bovino, superantant 20% a partir de uma linha A6 Xenopus rim celular, e 0,25% do normal Xenopus soro. </li></ul> 10. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Análise estereoscópica de rejeição do enxerto de pele 12 dias pós-transplante. LG-6 sapo clonado recebeu um enxerto de pele de ambos (A) um MHC-idênticos LG-6 (não mostra rejeição) ou (B) um doador de MHC-díspares outbred (80% de rejeição). Setas mostra células pigmentadas iridophore prateado marcação saudável do tecido (não rejeitada) enxertados. (*) Marcos de não pinças, devido à rejeição. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Gp96 facilita a apresentação cruzada de antígenos de tumor em Xenopus. LG-15 PLs (5 x 10 5) foram pulsado de 1 hora no gelo ou com APBS (controle negativo), 1 mg de recombinante gp96 purificada a partir de um E. Cultura coli, ou 1 ou 0,5 mg de gp96 purificada a partir de 15 / 0 tecido tumoral. Após 3 lavagens, as células foram transferidos para destinatários adotivamente LG-15 para adultos (1 x 10 6 individual /). Três dias depois, ao vivo 15 / 0 células tumorais (5 x 10 5) foramtransplantado por injeção sc. Cada curva representa a cinética de crescimento do tumor em um sapo. Dias após o desafio, quando apareceu pela primeira vez tumores foram monitorados, eo tamanho do tumor foi determinada periodicamente com um (comprimento x largura x espessura) paquímetro.

<ol><li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li>
<li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li>
<li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u, L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis%3A+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li>
<li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li>
<li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li>
<li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li>
<li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li>
<li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li>
<li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity%3A+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O anfíbio Xenopus é um exclusivo modelo de não-mamíferos versátil para estudar a imunidade. Sua ampla utilização na pesquisa biomédica e imunológicos rendeu em muitas ferramentas de pesquisa importantes, como os clones MHC definido LG-6 e LG-15, bem como linhas de células diferentes e anticorpos monoclonais. Usando essas ferramentas nós estabelecemos diferentes in vitro e em ensaios in vivo para estudar a capacidade das proteínas de choque térmico, como gp96 para mediar potente Ag-esp...

<table><tbody><tr><td>&lt;forte&gt;Reagentes necessários:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salina Tamponada com Fosfato para Anfíbios (APBS): </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 1,15 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,2 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH 10 N </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaina Metano Sulfonato (TMS, MS-222) </td><td>Crescent Research Chemicals</td><td>CAS#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio </td><td>Fisher Scientific</td><td>S-233-500</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Sal de Sódio da Heparina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura para tumores Xenopus 15/0 [ver 3 para mais detalhes]:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio basal Iscove DMEM</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primatone</td><td>Divisão de Produtos Sheffield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;2-mercaptoetanol&amp;#8211;etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃ </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% água destilada duplamente </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% soro bovino fetal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% do sobrenadante de uma linhagem celular de rim de Xenopus, A6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% de soro normal de Xenopus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Materiais e Equipamentos:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estéreis de centrífuga de 50 e 15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agulhas estéreis Precision Glide de 25 mm de diâmetro e 5/8 de polegada</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 gauge 1&amp;frac12; Aguilhas estéreis Precision Glide</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril de 1 ml com ponta lisa para tuberculina</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril com ponta de encaixe de 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (esterilizados)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de poliestireno estéreis, 60 x 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio premium 25 x 75 mm x 1 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de vidro de 10 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; Pipetas Pasteur Descartáveis de Vidro Borossilicato Durex com Tampão de Algodão</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulação Tygon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dois joalheiros suíços nº 5&amp;rsquo;s Pinça</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica microdissecante McPherson-Vannas com borda reta de corte de 6 mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paquímetros Helios </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de alta intensidade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desligar o bico de Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;incubadora com agitação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugação</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comparativo in vivo estudo da gp96 adjuvante no sapo xenopus laevis</em

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Temos desenvolvido no Xenopus laevis anfíbios um modelo não-mamíferos única de estudar a capacidade das proteínas de choque térmico certos (HSPs) como gp96 para facilitar a apresentação cruzada de antígenos chaperoned e provocar inata e adaptativa respostas de células T. Xenopus rejeição do enxerto de pele fornece uma excelente plataforma para estudar a capacidade de gp96 para provocar clássicos MHC de classe Ia (classe IA) restringiu as respostas das células T. Além disso, o sistema modelo de Xenopus também oferece uma alternativa atraente aos ratos para explorar a capacidade de gerar respostas gp96 contra tumores que têm baixo-regulado suas moléculas de classe Ia escapando desta forma de vigilância imunológica. Recentemente, desenvolvemos um ensaio transferência adotiva de células em Xenopus clones usando leucócitos peritoneal como células apresentadoras de antígenos (APCs), e mostrou que pode gp96 prime T CD8 respostas de células in vivo contra antígenos de histocompatibilidade menores da pele, bem como contra o tumor do timo Xenopus 15 / 0 que não expressam moléculas Ia classe. Descrevemos aqui a metodologia envolvida para realizar essas análises, incluindo a transferência de elicitação pulsante, e adotivos de leucócitos peritoneal, bem como o enxerto de pele e ensaios transplante tumor. Além disso também estamos descrevendo a colheita e separação de leucócitos do sangue periférico utilizado para a citometria de fluxo e ensaios de proliferação que permitem uma melhor caracterização das populações efetoras envolvidas na rejeição da pele e anti-tumor respostas.

O sapo<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oferece um atraente modelo de não-mamíferos alternativa para explorar a capacidade da proteína de choque térmico, tais como para promover a gp96 antígeno-específica de células T CD8 respostas. Nós apresentamos métodos para o estudo<em&gt; In vivo</em&gt; Facilitação de apresentação cruzada de antígenos de tumor de pele e gp96.

Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis</em

Desenvolvemos no anfíbio Xenopus laevis um modelo não mamífero exclusivo para estudar a capacidade de certas proteínas de choque térmico (hsps), como a gp96, de...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a conservação evolutiva da proteína de choque térmico G 96 em promover respostas de células T CD8 específicas para antígenos no sapo Xenopus laevis. Isso é realizado primeiramente colhendo leucócitos peritoneais por meio de lavagem peritoneal. O segundo passo do procedimento consiste em pulsar os leucócitos peritoneais com GP 96 derivada de tumor, que atua como coadjuvante de antígenos menores e tumorais, após incubação e lavagens.Os leucócitos peritoneais são transferidos adotivamente por injeção intraperitoneal para sapos ingênuos, a fim de sensibilizar esses animais contra antígenos tumorais ou de histocompatibilidade menor. O terceiro passo do procedimento consiste em realizar um enxerto de pele ou desafiar os sapos sensibilizados com tumor, e monitorar o aparecimento do enxerto de pele, a rejeição ou a formação do tumor. O passo final do procedimento é obter sangue periférico para caracterizar os linfócitos T envolvidos nas respostas de rejeição de pele e anti-tumorais.No final, podem-se obter resultados que demonstram uma aceleração significativa na rejeição de enxertos de pele, bem como atrasos no aparecimento de tumores em sapos previamente sensibilizados com GP 96, por meio dos ensaios de enxerto de pele e desafio tumoral, respectivamente. Olá, sou Christina Koska no laboratório da Dra. Jacque Robert do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Centro Médico da Universidade de Rochester. Sou Tanya Cruz, também do laboratório da Dra. River.Hoje vamos mostrar um procedimento para sensibilizar rãs clonadas por meio da transferência adotiva de leucócitos peritoneais, seguido por ensaios de enxerto de pele e transplante de tumor. Além disso, também mostraremos como obter sangue periférico desses animais. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a capacidade da proteína de choque térmico GP96 de promover células CDAT específicas para antígenos em Salla, bem como para investigar os tipos celulares envolvidos.Ok, vamos começar. Os sapos utilizados em nossos experimentos são clones genéticos ISO provenientes da nossa colônia de criação na Universidade de Rochester. Para estimular os leucócitos peritoneais ou pls para coleta, utilize uma agulha de 25 mm de diâmetro e cinco oitavos para injetar, por via intraperitoneal, no sapo anestesiado, uma preparação de e. coli morta pelo calor. Três dias após a injeção, os pls são coletados por lavagem intraperitoneal.Para iniciar este procedimento, desinfete o abdômen do sapo anestesiado com uma pequena quantidade de etanol 70%. Em seguida, utilize uma agulha 18 gauge 1,5 para injetar cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril para anfíbios, ou PBS pré-aquecido à temperatura ambiente, na cavidade peritoneal. Remova a agulha e massageie suavemente o sapo por um minuto para garantir que o tampão injetado se equilibre com o fluido na cavidade corporal.Em seguida, insira uma nova agulha 18 gauge de 1,5 polegadas sem seringa no abdômen do sapo. Enquanto evita os vasos sanguíneos, colete o líquido peritoneal que escorrerá pela parte traseira da agulha em um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Certifique-se de recuperar o maior volume possível do líquido inicialmente injetado após a coleta dos pls.Coloque o sapo em um recipiente com água rasa até que ele acorde, momento em que poderá ser devolvido à sua gaiola. Após a coleta dos pls, centrifugue a 1000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante e ressuspenda. Suspenda os pls em PBS A frio.Transfira o pls RESSUSPENSO para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para pulsar o PLS com GP 96, adicione a quantidade apropriada de GP 96 ao pls e misture por pipetagem. Incube no gelo durante uma hora após uma hora.Centrifugue as células a 14.000 RPM durante um minuto. Para remover qualquer GP 96 não ligado, remova o sobrenadante. Adicione PBS A frio e ressuspenda.Suspenda novamente o centrífugo de PLS. Lave o S com A-P-B-S-A frio um total de três vezes para garantir que não reste G 96 residual após a lavagem final. Resuspenda os PLS pulsados em uma concentração de cinco vezes 10 à quinta PLS por 300 microlitros de PBS para transferência adotiva de PLS para seis receptores ingênuos LG.Injete intraperitonealmente 300 microlitros de pls pulsado por animal. Os sapos precisam ser sensibilizados pelo menos três dias antes dos experimentos de enxerto de pele ou desafio com tumor, que serão mostrados a seguir. A pele para enxerto é obtida de um sapo doador LG 15 anestesiado.Use uma tesoura para cortar e remover um pequeno pedaço de pele ventral, que é a pele abdominal com aparência prateada. Devido à presença de quatro células pigmentadas do ARI ao manipular o enxerto. É fundamental manipular o tecido o mínimo possível, pois isso causará danos ao enxerto.Segure a pele muito suavemente com a pin&ccedil;a e coloque-a em uma placa de Petri contendo PBS A frio. Mantenha a placa de Petri sobre. Coloque a pele em uma l&acirc;mina de vidro limpa e use uma l&acirc;mina de barbear para cortar enxertos individuais em peda&ccedil;os de cinco mil&iacute;metros por cinco mil&iacute;metros.Mantenha os fragmentos em PBS sobre gelo para enxertar a pele no anfíbio receptor LG seis. Primeiro, faça uma pequena incisão na pele dorsal do receptor anestesiado. Em seguida, insira o enxerto de cinco milímetros por cinco milímetros sob a pele com o lado prateado voltado para cima.Certifique-se de observar as marcações de tesoura e pinça nos enxertos, pois essas não são consideradas rejeição do enxerto. Uma vez iniciada a pontuação 24 horas depois, parte da pele do hospedeiro sobreposta precisa ser removida do enxerto. Use uma tesoura para recortar uma janela ao redor do enxerto, de modo que o enxerto possa ser visualizado livremente.Tenha cuidado para não tocar na pele do doador nem provocar sangramento. Comece a esboçar o enxerto imediatamente fazendo um rascunho. Enxerto de pele.A rejeição é determinada pela porcentagem de destruição do aridol na pele enxertada. O enxerto deve ser verificado a cada dois ou três dias sob o microscópio estereoscópico. Prepare as células tumorais para transplante por ressuspendência, suspendendo-as em meio de cultura tumoral na densidade de cinco vezes 10 à quinta potência de células por 300 microlitros.Transplante as células por injeção subcutânea em um lado da região dorsal do animal. Cinco vezes 10 elevado a cinco células em um volume de 300 microlitros são injetadas por rã. O crescimento tumoral iniciará dentro de duas a três semanas após o desafio com o tumor.Observe a aparência inicial do tumor. Use paquímetros para medir as dimensões do tumor e registre seu volume a cada dois ou três dias antes da coleta de leucócitos sanguíneos do sapo. Prepare agulhas de vidro puxando pontas de pipeta sobre uma chama.Após afiar a extremidade fina da pipeta sob o microscópio estereoscópico, conecte a pipeta a um tubo plástico de aspiração. Para iniciar a coleta de sangue, corte a pele acima do pé posterior do sapo anestesiado para expor a veia tarsal dorsal. Encha a agulha de vidro com um a dois mililitros de solução de PBS A frio adicionada de heparina.Em seguida, insira a agulha de vidro na veia e comece a coletar o sangue aspirando lentamente com a boca. Pode-se obter de um a dois mililitros de sangue de um sapo de tamanho médio. O pequeno corte na perna do sapo não precisa ser costurado.A ferida cicatrizará dentro de uma semana. Aqui são apresentados os resultados de uma análise por microscopia estereoscópica da rejeição de enxerto de pele 12 dias após o transplante. Um sapo LG seis clonado que recebeu um enxerto de pele de um doador LG seis com MHC idêntico não apresentou rejeição.O asterisco indica a pinça marcadora não relacionada à rejeição. Em contraste, um sapo clonado LG seis que recebeu um enxerto de pele de um doador não aparentado com MHC distinto apresenta 80% de rejeição. Em ambas as imagens, as setas indicam células pigmentadas iridescentes prateadas que marcam tecido enxertado saudável e não rejeitado.No próximo experimento, plasmócitos LG-15 foram estimulados com PBS como controle negativo, GP 96 recombinante purificado de um cultivo de *E. coli* ou GP 96 purificado de células de tecido tumoral 15 zero. Em seguida, essas células foram transferidas adotivamente para receptores adultos LG-15, e três dias depois células tumorais 15 zero vivas foram transplantadas por injeção subcutânea. Tumores que surgiram após o desafio foram monitorados e o tamanho dos tumores foi medido periodicamente. Nestes gráficos, cada curva representa a cinética do crescimento tumoral em um sapo. Os resultados mostram que os animais previamente sensibilizados com 0,5 ou um micrograma de GP 96 apresentaram atraso significativo no aparecimento do tumor em comparação com os grupos-controle. Portanto, GP 96 facilita a apresentação cruzada de antígenos tumorais em *Xenopus*.Portanto, acabamos de mostrar a você como explorar a capacidade da GP96 de representar tanto antígenos menores quanto antígenos tumorais na rã *Xenopus laevis* por meio de ensaios de enxerto de pele e transplante de tumor. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de evitar a coleta de lavagem peritoneal se um vaso sanguíneo tiver sido danificado, já que a maioria das células será de eritrócitos e não de macrófagos. Também é importante evitar comprimir o tecido com a pinça ao manipular o enxerto de pele, a fim de evitar danos.É isso aí. Obrigado por realizar a lavagem e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Este vídeo demonstra uma técnica de homogeneização eficiente para gerar uma emulsão antigénio-adjuvante para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) num modelo murino. A emulsão contém um autoantígeno - glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - na fase aquosa, cercada por uma fase oleosa contínua composta por uma bactéria patogênica inativada. A emulsão garante uma liberação sustentada de antígenos para uma resposta imune prolongada.

Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso em vivo. Descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas em condições normais de criação ou após lesão.

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

O desenvolvimento do ensaio ELISpot para cobaia PBMCs interferão-gama permite a caracterização das respostas de células T neste modelo altamente relevantes para o estudo de doenças infecciosas. Temos aplicado o ensaio para medir respostas de células T associadas a intradérmica entrega de vacinas de DNA.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.

In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.

Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Aprenda a investigar a proteína gp96 em respostas imunes de células T CD8 usando Xenopus laevis. Este método permite estudar a apresentação cruzada de antígenos tumorais e cutâneos em modelo não mamífero.

Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis

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