Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis

O objetivo geral deste procedimento é estudar a capacidade de conservação evolutiva da proteína de choque térmico G 96 para promover respostas de células T CD oito específicas do antígeno nas mangas de xenopus de rã. Isso é feito pela primeira coleta de leucócitos peritoneais por lavagem peritoneal. O segundo passo do procedimento é pulsar os leucócitos peritoneais com GP 96 derivado do tumor que acompanha os antígenos menores e tumorais após a incubação e lavagens.

Os leucócitos peritoneais são transferidos adotivamente por injeção intraperitoneal em rãs virgens, a fim de prepará-las contra antígenos tumorais ou de histocompatibilidade menor. A terceira etapa do procedimento é desafiar o enxerto de pele ou o tumor das rãs preparadas e monitorar o início do enxerto de pele, rejeição ou aparecimento do tumor. A etapa final do procedimento é a obtenção de sangue periférico para caracterização das células T envolvidas na rejeição da pele e nas respostas antitumorais.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma aceleração significativa da rejeição do enxerto de pele, bem como atrasos no aparecimento do tumor em rãs preparadas com GP 96 através do enxerto de pele e dos ensaios de desafio do tumor, respectivamente. Olá, sou Christina Koska no laboratório do Dr. Jacque Robert no Departamento de Microbiologia e Imunologia do Centro Médico da Universidade de Rochester. Eu sou Tanya Cruz também do laboratório do Dr. River.

Hoje mostraremos um procedimento para preparar sapos clones por transferência adotiva de leucócitos peritoneais, seguido de enxerto de pele e ensaios de transplante de tumor. Além disso, também mostraremos como obter sangue periférico desses animais. Usamos esse procedimento em nosso estudo para estudar a capacidade de aquecer sua proteína GP 96 para promover células CDAT específicas do antígeno em Salla, bem como para estudar os tipos de células envolvidos.

Ok, então vamos começar. As rãs usadas em nossos experimentos são clones genéticos ISO de nossa colônia de reprodução na Universidade de Rochester. Para obter leucócitos peritoneais ou pls para a colheita, use uma agulha de calibre 25 cinco oito para injetar o sapo anestesiado intraperitoneal com uma preparação de e coli morta pelo calor Três dias após a injeção, os pls são colhidos por lavagem intraperitoneal.

Para iniciar este procedimento, desinfete o abdômen do sapo anestesiado com uma pequena quantidade de etanol a 70%. Em seguida, use uma agulha de calibre 1,5 18 para injetar cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato anfíbio estéril ou um PBS pré-guerra à temperatura ambiente na cavidade peritoneal. Remova a agulha e massageie suavemente o sapo por um minuto para garantir que o tampão injetado seja igual ao fluido na cavidade corporal.

Em seguida, insira uma nova agulha calibre 1.5 1.5 sem seringa no abdômen do sapo. Evitando os vasos sanguíneos, colete o fluido peritoneal que pingará da parte de trás da agulha em um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Certifique-se de recuperar o máximo possível do volume inicial injetado após a colheita.

Coloque o sapo em um recipiente com água rasa até que ele esteja acordado, momento em que ele pode ser colocado de volta em sua gaiola. Uma vez colhidos os pls, centrifugue a 1000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius, remova o sup, o natant e o resus. Suspenda o pls no frio A PBS.

Transfira o PLS RESUSPENDED para um microtubo de lixo de 1,5 mililitro. Para pulsar o PLS com GP 96. Adicione a quantidade apropriada de GP 96 ao pls e misture pipetando, incube no gelo por uma hora após uma hora.

Centrifugar as células a 14 000 rpm durante um minuto. Para remover qualquer GP 96 não vinculado, remova o sobrenadante. Adicione A PBS frio e resus.

Suspenda a centrífuga PLS novamente. Lave o S com A-P-B-S-A frio total de três vezes para garantir que não haja G 96 residual após a lavagem final. Resus suspende os pls pulsados em uma concentração de cinco vezes 10 elevado a cinco pls por 300 microlitros de um PBS para transferir adotivamente pls para seis receptores LG ingênuos.

Injeção intraperitoneal de 300 microlitros de pls pulsados por animal. As rãs precisam ser preparadas pelo menos três dias antes dos experimentos de enxerto de pele ou desafio tumoral, que serão mostrados a seguir. A pele para enxertia é obtida de uma rã doadora LG 15 anestesiada.

Use uma tesoura para cortar e remover um pequeno pedaço de pele ventral, que é a pele abdominal que parece prateada. Devido à presença de IRA, quatro células pigmentadas durante o manuseio do enxerto. É crucial ter o mínimo de manipulação possível do tecido, pois isso causará danos ao enxerto.

Segure a pele muito suavemente com a pinça e coloque-a em uma placa de Petri contendo A PBS frio. Mantenha a placa de Petri ligada. Coloque a pele em uma lâmina de vidro nova e use uma navalha para cortar enxertos individuais em pedaços de cinco milímetros por cinco milímetros.

Mantenha os fragmentos em um PBS no gelo para enxertar a pele no sapo receptor LG six. Primeiro, faça uma pequena incisão na pele dorsal do receptor anestesiado. Em seguida, insira o enxerto de cinco milímetros por cinco milímetros sob a pele com o lado prateado para cima.

Certifique-se de observar as marcações de tesoura e fórceps nos enxertos, pois elas não são contadas como rejeição do enxerto. Uma vez que a pontuação começa 24 horas depois, uma parte da pele do hospedeiro sobreposta precisa ser removida do enxerto. Use uma tesoura para cortar uma janela ao redor do enxerto para que o enxerto possa ser visualizado livremente.

Tenha cuidado para não tocar na pele do doador ou induzir sangramento. Comece a marcar o enxerto imediatamente, fazendo um esboço. Enxerto de pele.

A rejeição é determinada pela porcentagem de destruição do ídolo na pele enxertada. O enxerto deve ser verificado a cada dois ou três dias ao microscópio estereoscópico. Prepare as células tumorais para transplante por resus, suspendendo-as em meio de cultura tumoral a uma densidade de cinco vezes 10 a cinco células por 300 microlitros.

Transplante as células por injeção subcutânea em um lado do lado dorsal do animal. Cinco vezes 10 elevado a cinco células em volume de 300 microlitros é injetado por rã. O crescimento do tumor começará dentro de duas a três semanas após o desafio do tumor.

Observe a aparência inicial do tumor. Use paquímetros para medir as dimensões do tumor e registre seu volume a cada dois ou três dias antes da coleta de leucócitos sanguíneos do sapo. Prepare agulhas de vidro puxando peppes de macarrão sobre uma chama.

Depois de afiar a extremidade fina da pipeta sob o microscópio estéreo, conecte a pipeta a um tubo plástico de aspiração. Para iniciar a coleta de sangue, corte a pele acima do pé posterior da rã anestesiada para expor a veia dorsal do tarso. Encha a agulha de vidro com um a dois mililitros de solução gelada de A PBS mais heparina.

Em seguida, insira a agulha de vidro na veia e comece a coletar sangue aspirando lentamente com a boca. Um a dois mililitros de sangue podem ser obtidos de um sapo de tamanho médio. A pequena incisão na perna do sapo não precisa ser costurada.

A ferida cicatrizará dentro de uma semana. Os resultados de uma análise microscópica estereoscópica da rejeição do enxerto de pele 12 dias após o transplante são mostrados aqui. Um sapo clonado LG seis que recebeu um enxerto de pele de um doador LG seis idêntico ao MHC não apresentou rejeição.

O asterisco indica que a pinça marcadora não é devido à rejeição. Em contraste, um sapo clonado LG seis que recebeu um enxerto de pele de um doador externo díspar do MHC mostra 80% de rejeição. Em ambas as imagens, as setas indicam quatro células pigmentadas íridas, marcando tecido saudável não rejeitado.

Neste próximo experimento, LG 15 pls foram pulsados com um PBS como um controle negativo recombinante GP 96 purificado de uma cultura de e coli ou GP 96 purificado de 15 células de tecido tumoral zero foram então transferidas adotivamente para LG 15 receptores adultos e três dias depois 15 células tumorais zero vivas foram transplantadas por tumores de injeção subcutânea que apareceram pela primeira vez dias após o desafio foram monitorados e o tamanho do tumor foi medido periodicamente em Nesses gráficos, cada curva representa a cinética do crescimento do tumor em um sapo. Os resultados mostram que os animais preparados com 0,5 ou um micrograma de GP 96 atrasaram significativamente o aparecimento do tumor em comparação com os grupos controle. Portanto, a GP 96 facilita a apresentação cruzada de antígenos tumorais em xenopus.

Então, acabamos de mostrar como explorar a capacidade do GP 96 de representar antígenos menores e tumorais no sapo xap lavis por enxerto de pele e ensaios de transplante de tumor. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de evitar a coleta de lavagem peritoneal se um vaso sanguíneo tiver sido danificado, pois a maioria das células dentro dos eritrócitos e não dos macrófagos. Também é importante evitar apertar o tecido com a pinça ao manipular o enxerto de pele para evitar danos.

Então é isso. Obrigado pela lavagem e boa sorte com seus experimentos.