DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

O objetivo geral deste procedimento é recuperar DNA de microrganismos ativos que consumiram um substrato de crescimento de interesse, sem a necessidade de cultivo em laboratório. Isso é realizado primeiramente incubando uma amostra ambiental com um substrato de interesse marcado com isótopo estável, em condições semelhantes às encontradas no ambiente nativo. O segundo passo do procedimento consiste em extrair o DNA total dessa amostra marcada com isótopo.

O terceiro passo do procedimento é submeter este DNA à ultracentrifugação em gradiente de densidade em cloreto de césio. O passo final do procedimento é fracionar o gradiente de densidade para obter DNA pesado e leve para caracterização molecular subsequente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que revelam a identidade de microrganismos ativos, mas não cultivados, envolvidos no metabolismo de um substrato particular por meio de uma variedade de técnicas moleculares possíveis, incluindo fingerprinting, microarranjo, hibridização, análise de clone, biblioteca e metagenômica.

Olá, sou Josh Neufeld do Departamento de Biologia da Universidade de Waterloo. Sou Eric Dunford, aluno de pós-graduação no Laboratório Newfeld. Hoje vamos mostrar a você um procedimento de sondagem com isótopos de DNA, ou DNA-SIP, que se tornou uma técnica amplamente utilizada para associar a identidade de microrganismos desconhecidos e potencialmente não cultiváveis à sua capacidade de utilizar um substrato de crescimento de interesse.

Utilizamos este procedimento no laboratório Newfeld para estudar o metabolismo de fontes de carbono em uma variedade de ambientes terrestres e aquáticos. Hoje vamos demonstrar a aplicação de um substrato de carbono específico, glicose 13 C, a uma amostra de solo. Contudo, reconhecemos que, desde que este método foi inicialmente desenvolvido pelo grupo de Colin Merle na Universidade de Warwick, os pesquisadores têm diversificado o protocolo para aplicação em diversos ambientes diferentes, bem como utilizando uma variedade de diferentes isótopos marcados, como nitrogênio e oxigênio.

Hoje vamos nos concentrar no carbono, mas o protocolo em si pode ser aplicado a diferentes desenhos experimentais. Então, vamos começar. Antes do início deste procedimento, prepare todos os reagentes de sonda isotópica estável de DNA ou de DNA CYP conforme descrito na parte escrita deste protocolo.

O DNAC começa com a incubação da amostra. As condições de incubação variam amplamente dependendo de diversas características da amostra e do substrato. Uma vez determinadas empiricamente as condições apropriadas de incubação, adicione o respectivo condicionamento do substrato à amostra ambiental.

Você também pode optar por incluir nutrientes suplementares para permitir o crescimento microbiano, caso estes sejam necessários com base em incubações-teste. Uma vez que a incubação da amostra tenha sido preparada, tampe e feche hermeticamente a amostra, em seguida incube as amostras ambientais contendo o substrato marcado. O exemplo apresentado envolve a adição de uma solução de glicose marcada com carbono 13 a uma amostra de solo.

Em seguida, monte uma incubação controle para servir como comparação e confirmar a marcação aparente de ácidos nucleicos observada nas etapas subsequentes. Prepare esta amostra em condições idênticas, exceto pela utilização de carbono não marcado como substrato; tampe, feche e incube a amostra ambiental com o substrato não marcado nas mesmas condições. Após a incubação, extraia o DNA dos microcosmos utilizando um protocolo de extração adequado para as aplicações downstream desejadas. Em seguida, quantifique o DNA extraído para as etapas seguintes de ultracentrifugação utilizando um gel em condições desnaturantes e um espectrofotômetro.

Utilize rotores verticais ou quase verticais para ultracentrifugação, a fim de garantir a separação máxima possível entre o DNA leve e o pesado. O rotor Beckman Coulter VTI 65.2 possui 16 poços para acomodar tubos poliméricos seláveis de 5,1 mililitros, usados na preparação das amostras para ultracentrifugação. Primeiro, calcule o volume de DNA extraído necessário para adicionar de 0,5 a cinco microgramas de DNA aos tubos de ultracentrifugação.

Usando as concentrações de DNA previamente determinadas. Em seguida, determine a densidade exata da solução estoque de cloreto de césio utilizando um refratômetro digital. Conforme sugerido no protocolo escrito, calcule o volume da solução de DNA no tampão de gradiente necessário para gerar uma proporção de mistura apropriada.

Usando esses cálculos, combine o DNA extraído com tampão de gradiente e 4,8 mililitros de cloreto de césio em um tubo descartável estéril de 15 mililitros. O volume resultante será maior que a capacidade especificada dos tubos de centrífuga, a fim de preencher completamente os tubos. Por fim, homogeneíze a solução invertendo o tubo 10 vezes em variações deste protocolo.

Utilize uma força de flora, como ahy e brometo, na solução em gradiente para permitir a visualização do DNA dentro do tubo. A alteração da densidade do DNA ao ser preparado com DNA de cultura pura, incluindo um gradiente de brometo de AUM como mostrado aqui, é particularmente útil para fornecer confirmação visual imediata da formação do gradiente após cada centrifugação. Os passos para utilizar essa abordagem são descritos no protocolo escrito.

Para preparar a ultracentrifugação, utilize uma pipeta com uma ponteira e encha cuidadosamente os tubos de ultracentrífuga com as soluções de gradiente. Rotule os tubos no ombro do tubo com uma caneta permanente fina. Certifique-se de que os tubos sejam preenchidos exatamente até a base do pescoço do tubo, pois tubos insuficientemente preenchidos têm tendência a romper durante a ultracentrifugação.

Depois que todos os tubos necessários forem preenchidos com as soluções amostrais, registre a massa precisa de cada tubo, organize-os em pares com massas o mais próximas possíveis e adicione ou remova pequenas quantidades de solução até que fiquem balanceados dentro de 10 miligramas. Mantenha o nível da solução o mais próximo possível da base do tampão do tubo. Em seguida, feche os tubos utilizando uma tampa apropriada, conforme as instruções do fabricante.

Verifique se os tubos estão adequadamente selados invertendo-os e aplicando pressão moderada. Pese novamente os tubos para confirmar que ainda estão equilibrados após o fechamento, antes da ultracentrifugação. Inspecione cuidadosamente cada cavidade do rotor para garantir que estejam limpas e livres de poeira e detritos que possam perfurar os tubos durante a ultracentrifugação.

Insira os tubos no rotor, colocando os pares balanceados em posições opostas. Registre a posição do rotor de cada amostra, pois o processo de ultracentrifugação pode tornar as etiquetas de marcação ilegíveis. Selle cuidadosamente os poços do rotor conforme indicado pelo fabricante.

Uma vez que os poços do rotor tenham sido selados, coloque o rotor no ultracentrífugo. Feche a porta do ultracentrífugo e aplique vácuo para o rotor VTI 65.2. Ajuste a velocidade de rotação para 44.100 RPM, a temperatura para 20 graus Celsius e o tempo de ultracentrifugação para 36 a 40 horas.

Certifique-se de que o vácuo esteja ligado, selecione a aceleração máxima e desligue o freio para garantir que o gradiente não seja interrompido pela desaceleração. Imediatamente após a ultracentrifugação, remova o rotor com cuidado. Tenha cuidado para não inclinar nem bater no rotor, a fim de evitar perturbar os gradientes dentro dos tubos.

Por fim, remova cuidadosamente os tubos para a fracionamento do gradiente. O DNA pode ser extraído dos tubos de ultracentrifugação utilizando a técnica de fracionamento. Para começar, encha uma seringa estéril de 60 mililitros com água destilada e deionizada estéril contendo quantidade suficiente de corante azul propofol.

Para obter uma cor azul-escura, coloque a seringa no braço de carregamento da bomba de seringa. Em seguida, acople um tubo de bomba com uma agulha de 23 graus e uma polegada de comprimento e ligue a bomba até que um pouco de água saia pela extremidade da agulha. Evite bolhas de ar no suprimento de água, pois elas afetarão negativamente o processo de fracionamento.

Para cada amostra, prepare 12 tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mililitro com rótulos indicando o número da amostra e a fração. Em seguida, fixe um dos tubos de ultracentrifugação em um suporte com braçadeira com um movimento rápido e controlado. Fure a base do tubo ao longo da costura do tubo usando uma agulha nova de 23 graus e uma polegada e gire a agulha para garantir que um orifício uniforme tenha sido formado.

Pode-se constatar que luvas de látex oferecem melhor aderência ao eixo da agulha do que luvas de nitrila. Usando a agulha conectada à tubulação da bomba, perfure a parte superior do tubo no ombro superior do tubo ao longo da costura, de maneira rápida e controlada. Observe que também é possível perfurar primeiro a parte superior do tubo e depois a parte inferior.

Além disso, observe que uma pequena quantidade de óleo mineral revestindo a parede do tubo pode ajudar a prevenir vazamentos causados por um selo inadequado ao redor da agulha superior com uma bomba previamente calibrada. Empurre a água corada para o topo do tubo para obter 12 frações de 425 microlitros em 12 minutos. Use um cronômetro para coletar a solução em gradiente nos tubos de microcentrífuga identificados.

Por fim, verifique a densidade de todas as frações em pelo menos uma amostra ou gradiente controle. Utilizando um refratômetro digital. Espere valores na faixa de 1,690 a 1,760 gramas por mililitro, com densidade mediana de aproximadamente 1,725 gramas por mililitro para precipitar o DNA de todas as frações.

Primeiro, adicione 20 microgramas de poliacrilamida linear como carreador para precipitação e misture por inversão. Em seguida, adicione dois volumes da solução de PEG e novamente misture por inversão. Deixe os tubos à temperatura ambiente por duas horas para permitir a precipitação do DNA após a incubação.

Coloque as amostras em uma microcentrífuga com os tubos orientados na mesma direção para garantir uma localização consistente do pellet na centrífuga. Centrifugue os tubos a 13.000 G por 30 minutos; após a centrifugação, retire as amostras da microcentrífuga e aspire cuidadosamente, descartando o sobrenadante. Nesta etapa, o pellet deve estar visível com a ajuda de uma fonte de luz intensa.

Lave o pellet com 500 microlitros de etanol 70% após a lavagem do pellet por centrifugação. Centrifugue as amostras a 13.000 ×g por 10 minutos e, após a centrifugação, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante. O pellet estará mais visível agora, mas se dissociará da parede do tubo com maior facilidade.

Deixe o pellet secar à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a secagem dos pellets, suspenda cada pellet em 50 microlitros de tampão TE. Por fim, aplique cinco microlitros de cada fração em um gel de agarose para caracterizar as frações do gradiente utilizando os métodos descritos no protocolo escrito.

Resultados típicos do SIP de DNA demonstrarão uma separação do DNA marcado e não marcado na forma de gradiente por ultracentrifugação. Idealmente, haverá uma resolução completa do material genético de alto peso molecular, como o contendo carbono-13 e nitrogênio-15, do material não marcado, em particular perfis moleculares únicos baseados em PCR associados às frações quatro a oito de amostras incubadas com isótopos estáveis, mas não com substrato nativo. Controles incubados fornecem fortes evidências ligando organismos específicos ao metabolismo de um substrato marcado particular quando realizados com DNA de duas culturas puras: a cepa de *Methyloccus capsulatus* marcada com carbono-13 e a *Syntrophomonas mediitativus* ATCC 1021 não marcada; o DNA genômico marcado e não marcado se separa em frações gradientes distintas com densidades diferentes.

Neste exemplo, o DNA marcado com isótopos pesados pode ser observado nas frações quatro a cinco, enquanto o DNA não marcado é encontrado em altas concentrações nas frações nove a dez. O DNA amplificado por PCR a partir das mesmas frações foi analisado por eletroforese em gel desnaturante com gradiente, ou DGGE, gerando padrões de bandas discretos correspondentes aos dois organismos incluídos no gradiente. A densidade das frações varia de aproximadamente 1,580 a 1,759 gramas por mililitro, e estão dispostas em ordem decrescente de densidade da esquerda para a direita.

Por outro lado, a separação de isótopos e as incubações de amostras ambientais podem ser mais difíceis de interpretar. Solos de tundra da Baía Resolute, Canadá, foram incubados com glicose marcada com carbono 12 ou carbono 13 por um período de 14 dias a 15 graus Celsius. Os géis de agarose do DNA fracionado em gradiente revelaram um espectro de DNA genômico nas frações sete a dez, tanto para as incubações com carbono 12 quanto com carbono 13.

No entanto, quando a EGGD de genes de RNA ribossomal 16S foi utilizada para determinar o enriquecimento de carbono-13 na biomassa de táxons microbianos específicos, o solo incubado com glicose carbono-12 gerou padrões semelhantes em todas as frações do gradiente, enquanto a amostra incubada com glicose carbono-13 produziu perfis de EGGD exclusivamente associados às frações cinco a oito; as bandas conservadas indicadas pelas setas representaram um filotipo dominante consistente em todas as frações do gradiente. O filotipo apresenta um deslocamento para frações mais pesadas no DNA obtido do solo incubado com glicose carbono-13. A identidade desse gene específico de RNA ribossomal 16S pode ser determinada para orientar abordagens subsequentes baseadas em metagenômica ou cultivo.

Acabamos de mostrar como realizar um experimento de sondagem com isótopos estáveis de DNA, desde a incubação das amostras até a obtenção de DNA marcado para análise molecular. Ao realizar este procedimento, é importante considerar cuidadosamente o seu delineamento experimental e ter cuidado para não adicionar substrato em excesso, a fim de evitar o viés do experimento em favor de organismos de crescimento rápido. Você também deve evitar incubações prolongadas para que o substrato não se dilua entre outros membros da comunidade por meio da cadeia alimentar.

Portanto, você deseja usar apenas a quantidade certa de substrato e tempos de incubação suficientes para permitir a detecção de pequenas quantidades de DNA marcado em frações pesadas por meio de aplicações sensíveis baseadas em PCR. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.