DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

O objetivo geral deste procedimento é recuperar DNA de microrganismos ativos que consumiram um substrato de crescimento de interesse sem o pré-requisito de cultivo em laboratório. Isso é feito primeiro incubando uma amostra ambiental com um substrato de interesse marcado com isótopo estável em condições semelhantes às encontradas no ambiente nativo. A segunda etapa do procedimento é extrair o DNA total dessa amostra marcada com isótopos.

A terceira etapa do procedimento é submeter esse DNA à ultracentrifugação com gradiente de densidade em cloreto de césio. A etapa final do procedimento é fracionar o gradiente de densidade para obter DNA pesado e leve para posterior caracterização molecular. Em última análise, podem ser obtidos resultados que revelam a identidade de microrganismos ativos, mas não cultivados, envolvidos no metabolismo de um substrato específico por meio de uma variedade de técnicas moleculares possíveis, incluindo impressão digital, microarray, hibridização, clone, análise de biblioteca e metagenômica.

Olá, sou Josh Neufeld, do Departamento de Biologia da Universidade de Waterloo. Eu sou Eric Dunford, um estudante de pós-graduação no Newfeld Lab. Hoje mostraremos um procedimento para sondagem de isótopos de DNA, ou sip de DNA, que se tornou uma técnica amplamente utilizada para vincular a identidade de microrganismos desconhecidos e potencialmente não cultivados com sua capacidade de usar um substrato de crescimento de interesse.

Usamos esse procedimento no laboratório de Newfeld para estudar o metabolismo de fontes de carbono em uma variedade de ambientes terrestres e aquáticos. Hoje mostraremos a aplicação de um substrato de carbono específico 13 C glicose em uma amostra de solo. Mas reconhecemos que, desde que esse método foi desenvolvido pela primeira vez pelo Grupo de Colin Merle na Universidade de Warwick, os pesquisadores diversificaram o protocolo para ser aplicado a uma variedade de ambientes diferentes e também usando uma variedade de isótopos marcados diferentes, como nitrogênio e oxigênio.

Hoje vamos nos concentrar no carbono, mas o protocolo em si pode ser aplicado a diferentes projetos experimentais. Então vamos começar. Antes do início deste procedimento, prepare todas as sondagens de isótopos estáveis de DNA ou reagentes de DNA CYP conforme descrito na parte escrita deste protocolo.

O DNAC começa com a incubação da amostra. As condições de incubação variam muito, dependendo de uma variedade de características da amostra e do substrato. Uma vez determinadas empiricamente as condições de incubação adequadas, adicionar a alteração de substrato adequada à amostra ambiental.

Você também pode optar por incluir nutrientes suplementares para permitir o crescimento microbiano, se necessário, com base em incubações de teste. Uma vez que a incubação da amostra tenha sido configurada, tampe e sele a amostra e, em seguida, incube as amostras ambientais contendo substrato rotulado. O exemplo mostrado envolve a adição de uma solução de glicose marcada com carbono 13 a uma amostra de solo.

Em seguida, configure uma incubação de controle para servir como uma comparação para confirmar a marcação aparente do ácido nucléico observada nas etapas subsequentes. Preparar esta amostra em condições idênticas, exceto utilizando carbono não rotulado como tampa do substrato, selar e incubar a amostra ambiental com substrato não rotulado nas mesmas condições após o extracto de incubação, ADN dos microcosmos utilizando um protocolo de extracção adequado para as aplicações a jusante desejadas. Em seguida, quantificar o ADN extraído para as seguintes etapas de ultracentrifugação utilizando um gel aous e um espectrofotómetro.

Use rotores verticais ou quase verticais para ultracentrifugação para garantir a máxima separação possível de DNA leve e pesado. O rotor Beckman Coulter VTI 65.2 possui 16 poços para armazenar tubos de polímero de vedação rápida de 5,1 mililitros para preparar amostras para ultracentrifugação. Primeiro, calcule o volume de DNA extraído necessário para adicionar 0,5 a cinco microgramas de DNA aos tubos de ultracentrífuga.

Usando as concentrações de DNA previamente determinadas. Em seguida, determinar a densidade exata da solução-mãe de cloreto de césio usando um refratômetro digital. Conforme sugerido no protocolo escrito, calcule o volume de solução de DNA tampão gradiente necessário para gerar uma proporção de mistura apropriada.

Usando esses cálculos, combine o DNA extraído com tampão gradiente e 4,8 mililitros de cloreto de césio em um tubo estéril descartável de 15 mililitros. O volume resultante será maior que a capacidade especificada dos tubos da centrífuga para encher completamente os tubos. Finalmente faz a solução invertendo o tubo 10 vezes variações deste protocolo.

Use uma força de flora, como ahy e brometo, dentro da solução de gradiente para permitir que o DNA seja visualizado dentro do tubo. Alterar a densidade do DNA quando preparado com DNA de cultura puro, incluindo um gradiente de brometo de AUM, como mostrado aqui, é particularmente útil para fornecer confirmação visual imediata da formação de gradiente após cada centrífuga. As etapas de execução no uso dessa abordagem são descritas no protocolo escrito.

Para configurar a ultracentrifugação primeiro, use um bulbo e passe uma pipeta para encher cuidadosamente os tubos da ultracentrífuga com as soluções de gradiente. Rotule os tubos no ombro do tubo com um marcador permanente fino. Certifique-se de que os tubos estejam cheios exatamente até a base do gargalo do tubo, pois os tubos insuficientemente cheios tendem a estourar durante a ultracentrifugação.

Uma vez que todos os tubos necessários estejam cheios com as soluções de amostra, registre a massa precisa de cada tubo, classifique os tubos como pares correspondentes e adicione ou remova minhas novas quantidades de solução até que estejam equilibrados em 10 miligramas. Mantenha o nível da solução o mais próximo possível da base do tubo. Em seguida, sele os tubos usando um topper de tubo de acordo com as instruções do fabricante.

Verifique se os tubos estão bem vedados invertendo-os e aplicando pressão moderada. Pese os tubos novamente para verificar se eles ainda estão equilibrados após a vedação antes da ultracentrifugação. Inspecione cuidadosamente cada rotor para garantir que estejam limpos e livres de poeira e detritos que possam perfurar os tubos durante a ultracentrifugação.

Insira os tubos no rotor, colocando os pares balanceados opostos um ao outro. Registre a localização do rotor de cada amostra, pois o processo de ultracentrifugação pode tornar legíveis as etiquetas dos marcadores. Vede cuidadosamente os poços do rotor conforme indicado pelo fabricante.

Uma vez que os poços do rotor tenham sido selados, carregue o rotor na ultracentrífuga. Feche a porta da ultracentrífuga e aplique um vácuo para o rotor VTI 65.2. Defina a velocidade de rotação para 44, 100 RPM, a temperatura para 20 graus Celsius e o tempo de ultracentrifugação para 36 a 40 horas.

Certifique-se de que o vácuo esteja na aceleração máxima selecionada e desligue o freio para garantir que o gradiente não seja interrompido pela desaceleração. Imediatamente após a ultracentrifugação, remova o rotor com cuidado. Tenha cuidado para não inclinar ou bater o rotor para evitar perturbar os gradientes dentro dos tubos.

Por fim, remova cuidadosamente os tubos para fracionamento de gradiente. O DNA pode ser extraído dos tubos de ultracentrífuga usando a técnica de fracionamento. Para começar, encha uma seringa estéril de 60 mililitros com água destilada e deionizada estéril contendo corante azul de propofol suficiente.

Para fornecer uma cor azul escura, coloque a seringa no braço de carregamento da bomba de seringa. Em seguida, conecte a tubulação da bomba equipada com uma agulha de calibre 23 de uma polegada e ligue a bomba até que um pouco de água passe pela extremidade da agulha. Evite bolhas de ar no abastecimento de água, pois elas afetarão negativamente o processo de fracionamento.

Para cada amostra, preparar 12 tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitros com etiquetas indicando o número e a fracção da amostra. Em seguida, fixe um dos tubos de ultracentrifugação em um suporte de grampo com um movimento rápido e controlado. Perfure a parte inferior do tubo ao longo da costura do tubo usando uma agulha nova de calibre 23 de uma polegada e gire a agulha para garantir que um orifício uniforme tenha sido formado.

Você pode descobrir que as luvas de látex fornecem melhor aderência na haste da agulha do que as luvas de nitrilo. Usando a agulha que está presa ao tubo da bomba, perfure a parte superior do tubo no ombro do tubo superior ao longo da costura de maneira rápida e controlada. Observe que também pode ser feito perfurar a parte superior do tubo seguida pela parte inferior do tubo.

Além disso, observe que uma pequena quantidade de óleo mineral revestindo o ombro do tubo pode ajudar a evitar vazamentos de uma vedação inadequada ao redor da agulha superior com uma taxa de bomba previamente calibrada. Bombeie a água tingida para a parte superior do tubo para obter 12 fracções de 425 microlitros em 12 minutos. Use um temporizador para coletar a solução de gradiente nos tubos de microcentrífuga rotulados.

Por fim, verifique a densidade de todas as frações para pelo menos uma amostra ou gradiente de controle. Usando um refratômetro digital. Espere valores na faixa de 1,690 a 1,760 gramas por mililitro com uma densidade média de aproximadamente 1,725 gramas por mililitro para precipitar o DNA de todas as frações.

Primeiro, adicione 20 microgramas de poliacrilamida linear como transportador para precipitação e misture por inversão. Em seguida, adicione dois volumes de solução de PEG e misture novamente por inversão. Deixe os tubos em temperatura ambiente por duas horas para permitir que o DNA precipite após a incubação.

Colocou as amostras em uma microcentrífuga com os tubos orientados na mesma direção para garantir a localização consistente da centrífuga de pellets. Os tubos a 13.000 G por 30 minutos após a centrifugação recuperaram as amostras da microcentrífuga e, em seguida, aspiram e descartam cuidadosamente o aplicativo supernat. O pellet deve ser visível nesta fase com o auxílio de uma fonte de luz brilhante.

Lave o pellet com 500 microlitros de etanol a 70% após a lavagem da centrífuga de pellets. As amostras a 13 000 g durante 10 minutos após a centrifugação aspiram e rejeitam cuidadosamente o sobrenadante. O pellet será mais visível agora, mas se dissociará da parede do tubo com mais facilidade.

Deixe o pellet secar em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois que os pellets secarem, suspenda cada pellet em 50 microlitros de tampão TE. Finalmente, execute cinco microlitros de cada fração em um aeros gel para caracterizar as frações de gradiente usando métodos discutidos no protocolo escrito.

Os resultados típicos do DNA SIP demonstrarão uma separação de DNA marcado e não marcado na forma de gradiente por ultracentrifugação. Idealmente, haverá uma resolução completa de material genético de alto peso molecular, como carbono 13 e nitrogênio 15, de material não rotulado em particular, impressões digitais exclusivas baseadas em PCR associadas às frações quatro a oito de amostras incubadas de isótopos estáveis, mas não com substrato nativo. Os controles incubados fornecem fortes evidências ligando organismos específicos ao metabolismo de um substrato marcado específico quando realizado em DNA de duas culturas puras, banho de cepa de capsulite metil occus marcado com carbono 13 e Sian medi A TCC 10 21 não rotulado, rotulado como DNA genômico não marcado, separado em frações de gradiente respeitadas com densidades diferentes.

Neste exemplo, o DNA marcado com isótopos pesados pode ser observado nas frações de quatro a cinco, enquanto o DNA não marcado é encontrado em altas concentrações nas frações de nove a 10. O DNA amplificado por PCR das mesmas frações foi executado usando eletroforese em gel de desnaturação e gradiente ou DGGE e gerou padrões de bandas discretos correspondentes aos dois organismos incluídos no gradiente. A densidade das frações varia de aproximadamente 1.580 a 1.759 gramas por mililitro, e elas são mostradas em ordem decrescente de densidade da esquerda para a direita.

Por outro lado, a separação de isótopos e incubações de amostras ambientais pode ser mais difícil de interpretar. Os solos da tundra de Resolute Bay, Canadá, foram incubados com glicose marcada com carbono 12 ou carbono 13 por um período de 14 dias a 15 graus Celsius. Os aerogéis do DNA da fração de gradiente purificado revelaram DNA genômico de esfregaço nas frações sete a 10 para incubações de carbono 12 e carbono 13.

No entanto, quando DGGE de genes de RNA ribossômico 16 s foi usado para determinar o enriquecimento de carbono 13 de biomassa de táxons microbianos específicos, o solo incubado com glicose de carbono 12, o DNA gerou padrões semelhantes em todas as frações de gradiente, enquanto a amostra incubada de glicose de carbono 13 gerou impressões digitais DGG que estão exclusivamente associadas às frações cinco a oito, As bandas conservadas indicadas pelas setas representaram o tipo filo dominante consistente em todas as frações de gradiente. O tipo filo muda para frações mais pesadas para DNA obtido de solo incubado com glicose de carbono 13. A identidade deste gene específico de RNA ribossômico 16 s pode ser determinada para orientar abordagens metagenômicas ou baseadas em cultivo subsequentes.

Acabamos de mostrar como realizar um experimento de sondagem de isótopos estáveis de DNA, desde a incubação de amostras até a obtenção de DNA marcado para análise molecular. Ao realizar este procedimento, é importante considerar cuidadosamente seu projeto experimental, ter cuidado para evitar adicionar muito substrato a fim de evitar enviesar seu experimento para organismos de crescimento rápido. Você também deseja evitar a incubação prolongada para que o substrato não se dilua para outros membros de uma comunidade por meio de uma teia alimentar.

Portanto, você deseja usar a quantidade certa de substrato e tempos de incubação suficientes para permitir que você detecte uma pequena quantidade de DNA marcado em frações pesadas com aplicações sensíveis baseadas em PCR. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.