Name: DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Aprenda a identificar microrganismos ativos sem cultivo usando DNA-SIP com isótopos estáveis e ultracentrifugação em gradiente de densidade. Este método revela comunidades microbianas envolvidas em processos metabólicos específicos.

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Este trabalho foi financiado pelo Projeto Estratégico e Subsídios Descoberta a JDN das Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC).

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Projeto adequado de isótopos estáveis ​​experimentos sondagem é de importância crítica para a obtenção de DNA marcado acima da comunidade de fundo sem rótulo. Considerações sobre a amostra de tempos de incubação, as concentrações de substrato, condições de incubação (por exemplo, nutrientes, teor de umidade do solo), cross-alimentação e replicação têm sido discutidas em outros lugares 10,18 e recomendamos ao leitor consultar estas publicações quando se projeta um incubação SIP. Relacionadas com o protocolo at...

<table><tbody><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de césio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, grau reagente</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>Poliacrilamida linear</td><td>Reagente</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>Polietileno glicol 6000</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>Pelotas de hidróxido de sódio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader</td><td>Equipamento</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Equipamento</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Equipamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de infusão</td><td>Equipamento</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>Número do modelo: BSP&lt;br/&gt;Consulte &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt; para detalhes de pedido.</td></tr><tr><td>Selador de tubos</td><td>Equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga</td><td>Equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz ultravioleta</td><td>Equipamento</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>Qualquer fonte de UV é suficiente</td></tr><tr><td>Protetor facial contra luz ultravioleta</td><td>Equipamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>Tampões de borracha butílica, cinza</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Material</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica, 23 gauge, comprimento de 2&amp;#8221;</td><td>Material</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microfuga, 1,5 mL</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>Tampas centrais abertas, diâmetro de 20 mm</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur, vidro</td><td>Material</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>O número do catálogo é para pontas de 200 &amp;#x03BC;l. Pontas de 10 ou 20 &amp;#x03BC;l podem ser adquiridas na mesma fonte</td></tr><tr><td>Tubo da bomba com diâmetro interno de 1,5 mm x parede de 1,5 mm</td><td>Material</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos com tampa rosqueável, 15 mL</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de soro, volume de 125 mL</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>Seringa, 60 mL</td><td>Material</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-stable isotope probing (dna-sip)

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA estável-isótopo sondagem (DNA-SIP) é uma técnica poderosa para a identificação de microorganismos ativos que assimilar substratos de carbono especial e nutrientes em biomassa celular. Como tal, esta técnica de cultivo independente tem sido uma metodologia importante para a atribuição de função metabólica para as diversas comunidades que habitam uma grande variedade de ambientes terrestres e aquáticos. Após a incubação de uma amostra ambiental com isótopos estáveis ​​compostos marcados, extraídos de ácido nucléico é submetido a ultracentrifugação de gradiente de densidade e fracionamento gradiente subseqüentes para separar ácidos nucléicos de densidades diferentes. Purificação de DNA a partir de cloreto de césio recupera rotulados e não rotulados DNA para a caracterização molecular posterior (por exemplo, impressões digitais, microarrays, bibliotecas clone, metagenomics). Este protocolo fornece vídeo JOVE visuais passo-a-passo explicações do protocolo para fracionamento de gradiente de densidade gradiente de ultracentrifugação, e recuperação de DNA rotulados. O protocolo também inclui dados de amostra SIP e destaca dicas importantes e cuidados que devem ser considerados para garantir uma análise de DNA SIP-sucedido.

DNA estável-isótopo sondagem é um método de cultivo independente para identificar e caracterizar as comunidades ativa de microorganismos que são capazes de utilizar substratos específicos. Assimilação do substrato enriquecido em isótopo pesado leva a incorporação de átomos marcados em biomassa microbiana. Ultracentrifugação em gradiente de densidade recupera DNA marcado para jusante análises moleculares.

DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

A sondagem de isótopos estáveis de DNA (DNA-SIP) é uma técnica poderosa para identificar microrganismos ativos que assimilam substratos de carbono específicos e ...

O objetivo geral deste procedimento é recuperar DNA de microrganismos ativos que consumiram um substrato de crescimento de interesse, sem a necessidade de cultivo em laboratório. Isso é realizado primeiramente incubando uma amostra ambiental com um substrato de interesse marcado com isótopo estável, em condições semelhantes às encontradas no ambiente nativo. O segundo passo do procedimento consiste em extrair o DNA total dessa amostra marcada com isótopo.O terceiro passo do procedimento é submeter este DNA à ultracentrifugação em gradiente de densidade em cloreto de césio. O passo final do procedimento é fracionar o gradiente de densidade para obter DNA pesado e leve para caracterização molecular subsequente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que revelam a identidade de microrganismos ativos, mas não cultivados, envolvidos no metabolismo de um substrato particular por meio de uma variedade de técnicas moleculares possíveis, incluindo fingerprinting, microarranjo, hibridização, análise de clone, biblioteca e metagenômica.Olá, sou Josh Neufeld do Departamento de Biologia da Universidade de Waterloo. Sou Eric Dunford, aluno de pós-graduação no Laboratório Newfeld. Hoje v

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Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

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Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glicose

Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.

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Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso de sondas de tensão baseadas em DNA para obter imagens das forças receptoras aplicadas por células imunes. Essa abordagem pode mapear forças receptoras &gt;4.7pN em tempo real e pode integrar forças ao longo do tempo.

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Neste vídeo, vamos mostrar-lhe como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas podem ser analisadas por ensaios de atividade em gel.

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