Name: Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a microdissecção de retina e epitélio pigmentar da retina em embriões de zebrafish de um a três dias pós-fertilização. Este método preserva tecidos intactos para estudos de expressão de RNA.

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Este trabalho é suportado por um fundo de arranque do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Purdue.

Parte 1: Preparativos antes microdissecção <ol><li> Soluções <ol class="lalpha"><li> E3 média 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 e 0,33 mM MgSO 4). </li><li> Solução de Ringer com 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH7.2), esterilizado por filtração. </li><li> 5N NaOH. </li></ol></li><li> Ataque químico de agulhas de tungstênio <ol class="lalpha"><li> Garantir um pequeno copo contendo NaOH 5N sobre uma placa de Petri por argila. </li><li> Anexar um clipe de papel no lado do copo, para que ele entra em contato com a solução de NaOH. </li><li> Conecte o eletrodo negativo de uma fonte de alimentação DC para o clipe de papel eo eletrodo positivo para uma extremidade de uma peça curta (~ 2 cm) de fio de tungstênio. </li><li> Enrole a outra ponta do fio de tungstênio com uma bola de barro e mergulhe esse fim na solução de NaOH. </li><li> Aumentar a tensão para cerca de 3V e mergulhe o fio para cima e para baixo na solução de NaOH até uma taxa de ataque bom é atingido. Uma agulha de boa qualidade geralmente pode ser gravado em 10 minutos. </li><li> O fio de tungstênio expostos à solução se tornará gradualmente mais fino. Quando a bola de barro cai, o outro lado do fio que ainda está ligado ao eletrodo positivo terá uma forma agulha fina. </li><li> Lavar a agulha fina com solução de Ringer ou E3 para remover os depósitos de sal. </li><li> Coloque a agulha para um aplicador de madeira por fita ou um suporte de agulha para fácil manuseio. </li></ol></li><li> Placas de cultura <ol class="lalpha"><li> O Falcon 60 x 15 mm placas de cultura de poliestireno está pronto para uso para microdissecção da retina. </li><li> Para dissecar RPE ligado à retina, esmagar dois embriões completamente em uma placa de cultura contendo solução de Ringer para se livrar da adesividade da superfície de 30 minutos antes da dissecção. Pouco antes de dissecação, lavar a placa com solução de Ringer extensivamente fresco é. </li></ol></li><li> Embriões de coleta e preparo <ol class="lalpha"><li> Peixe-zebra adulto são mantidas como descrito 4, 5. </li><li> Separar os peixes do pai em tanques de criação estática pairwise por um divisor na noite anterior de reprodução. </li><li> Remover o divisor após a luz da sala está ligada na manhã seguinte. Permitir que os pais a cruz em intervalos de 10 minutos a cada meia hora. Separar os peixes depois de cada cruzamento. </li><li> Manter os embriões coletados de cada cruzamento em meio E3 separadamente a 28 ° C. </li><li> Embriões em estágio de 10 a 12 horas após a fertilização (HPF) e resgatá imediatamente antes da dissecação nos pontos de tempo específico, de acordo com critérios estabelecidos 1, 6. </li></ol></li></ol> Parte 2: Dissecção - remoção de cérebro e exposição do olho 1 <ul><li> Os procedimentos descritos nesta seção são comuns para dissecar retina (parte 3A) e RPE ligado à retina (Parte 3B). </li><li> Todos dissecações fina são feitas por uma ponta da pinça Dumont e assistido por um outro par de fórceps Dumont para o posicionamento do tecido. Uma agulha de tungstênio quimicamente gravadas podem ser usadas para manipulações mais fino, se necessário. </li><li> Todos dissecações finas são realizados em ampliação ~ 5-8x sob um microscópio Olympus SZX16 equipado com um objetivo 1X ou equivalente. </li><li> Manter os embriões em meio E3 em uma bancada incubadora a 28 ° C ao lado do microscópio para o acesso fácil embrião durante a dissecção. </li><li> O estágio do microscópio é aquecida a 28 ° C por uma placa térmica para minimizar a influência da flutuação da temperatura na expressão gênica. </li></ul><ol><li> Transferência de um embrião em um estágio específico do desenvolvimento de solução de Ringer em um Falcon 60 X 15 milímetros placa de cultura preparado como descrito na Parte 1 # 3. </li><li> Cortar a cabeça com a parte anterior do tronco rapidamente a partir do corpo. </li><li> Pinos na extremidade posterior deste tecido na placa de cultura com a pinça auxiliar. </li><li> Abra a cabeça no lado dorsal a partir da testa anterior. </li><li> Remover o cérebro de modo que o lado medial dos olhos está exposta e é voltada para cima para manipulações mais. </li></ol> 3A parte: dissecção da retina 1 <ol><li> Prepare o embrião, como descrito na Parte 2. </li><li> Cuidadosamente a escova RPE expostos no lado medial do globo ocular que é voltada para cima pela ponta da pinça até que uma pequena abertura para a retina é visto. </li><li> Continue a escovação e peeling de ação até que o lado medial da retina é quase todo exposto. Evitar arranhões e socos na retina exposta. </li><li> Para remover o RPE lateral na retina que agora está voltado para baixo, a abordagem que e escova em um ângulo de aproximadamente 45 ° a partir da superfície da placa de cultura. </li><li> Remover o RPE que é anexado relativamente firmemente à ora serrata fixando a parte destacada do RPE ao cplaca ULTURA para dissecção, e levante a retina suavemente. </li><li> Rolar a retina no fundo do prato de cultura para limpar o RPE residual. <ol class="lalpha"><li> Percebemos que neste particular Falcon placa de cultura de poliestireno tem uma aderência preferencial de RPE por aproximadamente 20 minutos uma vez que um embrião é esmagado. Esta propriedade é utilizada para a remoção de restos RPE. No entanto, as células da retina se ater à superfície, em menor grau, o que pode ser inspecionado de perto sob alta ampliação. Um tem que encontrar um equilíbrio entre a integralidade da remoção do RPE e integridade da retina. </li><li> A lente geralmente adere à placa de cultura e se separa do retina durante o processo de laminação. Ocasionalmente, é necessário destacar a lente por uma agulha de tungstênio gravado com uma ação de roda na superfície da lente. </li></ol></li><li> Estes procedimentos podem remover com êxito o EPR da retina sem comprometer a integridade do tecido. Isto é indicado por uma boa morfologia geral (Figura 1B e B ') e histologia (Figura 1B "), a flecha, em particular, a preservação da matriz extracelular entre a camada de fotorreceptores ea RPE é excepcionalmente bom (Figura 1B."; comparar com a histologia do embrião inteiro (Figura 1A ")). </li></ol> 3B parte: RPE ligado à dissecção da retina 3 <ol><li> Prepare o embrião, como descrito na Parte 2. </li><li> Pin da cabeça até a placa de cultura pela forceps assistente. Levante os olhos suavemente do lado lateral posterior e rolar para o lado anterior. <ol class="lalpha"><li> A coróide presuntivo e tecido escleral do lado de fora da camada de RPE estão ligados relativamente bem para a pele e pode ser na maior parte descascada rolando o olho com atenção para o lado anterior. </li></ol></li><li> Remova a lente com uma agulha de tungstênio após a lateral do olho é exposta e quando o olho ainda está ligado à pele. </li><li> Estes procedimentos podem com sucesso preservar a camada RPE inteiro com a retina. Coróide presuntivo e tecido escleral pode ser em grande parte removido (Figura 1C, C 'e C "). </li></ol> Parte 4: coleta de amostra de tecido para o trabalho RNA <ol><li> As amostras dissecados podem ser coletados em TRIzol em um tubo de microcentrífuga RNase-free para jusante caracterização RNA como descrito anteriormente 1. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) e lateral (A) vista dorsal de uma cabeça de peixe-zebra larval em 52 hpf antes da dissecção. (A ") A seção correspondente histológica da cabeça larval em (A) e (A '). (B) e lateral (B) vista dorsal de uma retina dissecados aos 54 hpf. A superfície da retina estava intacto de ambos os laterais e vista dorsal. (B ") A seção correspondente histológica da retina dissecada em (B) e (B '). A estrutura da retina e laminação da retina estava intacto. Em particular, a matriz extracelular entre a camada de fotorreceptores e EPR (A ", setas) foi bem preservada na retina dissecados (B", setas). (C) e Lateral (C ') vista medial de um dissecados retina RPE-anexado aos 52 hpf. RPE camada estava intacta e contínua, que também foi indicada pela secção histológica do tecido dissecado (C "). A área branca no C 'é o nervo óptico (seta). Para histologia, amostras de tecidos foram coletados e fixados em 4% paraformaldeído. plástico incorporação e secção das amostras foram realizados conforme descrito 3. barra de escala = 50 mm.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Purdue Animal Care e do Comitê Use.

Microdissecção de tecidos oculares zebrafish pode efetivamente obter retinas intactas e RPE-anexado retinas. Este auxilia substancialmente estudos de expressão que pertencem a um tecido ocular específico (ie retina ou RPE). Na verdade, temos utilizado com sucesso destes procedimentos para obter perfis de expressão de RNA de toda a retina 1 e RPE 3. A utilidade destes perfis é fortemente apoiado pelos nossos recente identificação de vias e famílias de genes que são perturbados em uma diferenciação d...

<table><tbody><tr><td>Motor sem fio para pistilo</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de corrente contínua</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>Qualquer fonte de corrente contínua funcionará. A tensão específica de uma máquina diferente exigirá otimização adicional.</td></tr><tr><td>Pistilo descartável &amp;& microtubo, 1,5 mL (livre de DNase, RNase e pirogênio)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>São utilizados para coleta de tecido em TRIzol para análise de expressão.</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5, Pontas: 0,05 x 0,01 mm, Inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>A dimensão da ponta fina é desejável, mas não é inflexível, pois pode ser necessário afiar a ponta de tempos em tempos.</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5SF, Pontas: 0,025 x 0,005 mm, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>A dimensão da ponta fina é desejável, mas não é inflexível, pois pode ser necessário afiar a ponta de tempos em tempos.</td></tr><tr><td>Placas de cultura de poliestireno Falcon, 60 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>Essas placas são usadas como placas de dissecação.</td></tr><tr><td>Olympus SZX16 Microscópio Estereoscópico</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>Qualquer estereomicroscópio funcionaria. Utilizamos o estereomicroscópio Leica em estudos anteriores&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; sem quaisquer problemas. Também utilizamos exclusivamente a objetiva de 1X para a dissecação, mesmo tendo uma objetiva de 2X instalada. </td></tr><tr><td>Pedra de afiar</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>Use isso para afiar a ponta da pinça, se necessário</td></tr><tr><td>placa térmica</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>Isso é usado para manter a temperatura do tecido durante toda a dissecação e minimizar a influência da flutuação de temperatura na expressão gênica. Também colocamos todo o microscópio em uma sala com ambiente controlado a 28&amp;#x00B0;C durante a dissecação em estudos anteriores&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; com bom sucesso.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>fio de tungstênio, diâmetro de 0,015 polegadas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de madeira</td><td>Puritan</td><td>807</td><td>Isso é usado para segurar a agulha de tungstênio gravada quimicamente.</td></tr></tbody></table>

microdissecção de tecidos oculares zebrafish embrionárias

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Peixe-zebra é um modelo animal popular para a pesquisa sobre o desenvolvimento do olho por causa de sua rápida<em&gt; Ex utero</em&gt; Desenvolvimento e fecundidade bom. Por 3 dias após a fertilização (DPF), as larvas irá mostrar a primeira resposta visual. Muitos genes foram identificados até o controle de um desenvolvimento adequada para os olhos, mas estamos longe de um entendimento completo da arquitetura genética subjacente. Todo o genoma perfil de expressão gênica é uma ferramenta útil para elucidar rede regulatória genética para o desenvolvimento do olho. No entanto, o pequeno tamanho do olho embrionárias em peixes-zebra torna difícil obter tecidos oculares intacta e pura para análise de expressão. Por exemplo, o comprimento ântero-posterior do olho entre o dia 2 e 3 é apenas cerca de 200-300 mM, enquanto que o diâmetro da lente é mM menos 100. Além disso, o epitélio pigmentar da retina (EPR) subjacente à retina é apenas um epitélio de camada única. Enquanto perfis de expressão gênica pode ser obtido a partir do embrião todo, eles não representar fielmente a expressão desses tecidos. Portanto tecido puro deve ser obtido por um perfil de expressão gênica de sucesso do desenvolvimento do olho. Para resolver este problema, temos desenvolvido uma abordagem para microdissect retina intacta e retina com RPE anexada de dpf 03/01, que cobrem grandes etapas da morfogênese do olho. Todos os procedimentos podem ser feitos com uma pinça fina e material de laboratório em geral sob oculares standard. Para dissecção da retina, o RPE single-layer é removida e descascada por escovar a ação ea adesão preferencial dos remanescentes RPE para a superfície da placa de cultura para dissecção. Para RPE ligado à dissecção da retina, a adesão de RPE para a placa de dissecção é removido antes da dissecção de modo que a RPE pode ser completamente preservada com a retina. Uma ação de levantamento cuidadoso deste tecido pode eficientemente separar a coróide presuntivo e esclera. A lente pode ser removido em ambos os casos por uma agulha de tungstênio gravado quimicamente. Em resumo, nossa abordagem pode obter tecidos oculares intactos e tem sido utilizada com sucesso para estudar perfis de tecidos específicos expressão da retina zebrafish<sup&gt; 1, 2</sup&gt; E epitélio pigmentar da retina<sup&gt; 3</sup&gt;.

Este artigo descreve uma abordagem para microdissect retinas zebrafish com e sem epitélio pigmentar da retina em anexo, 1-3 embriões dia postfertilization.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

O peixe-zebra é um modelo animal popular para pesquisas sobre o desenvolvimento ocular devido ao seu rápido desenvolvimento ex utero e boa fecundidade. Aos 3 dias após...

Este vídeo mostra a microdissecação da retina e da retina com pigmento retiniano, epitélio pigmentado da retina, ou RPE, anexado de embriões de peixe-zebra com um a três dias pós-fertilização. Todos os procedimentos podem ser realizados com pinças finas e materiais de laboratório comuns. Sob microscópios estereoscópicos padrão para dissecação retiniana, a camada única de RPE é removida e destacada por meio de uma ação de escovação e da aderência do RPE à superfície da placa de cultura.Para a dissecção da retina com epitélio pigmentar retiniano (RPE) aderido, as propriedades adesivas da placa de cultura são removidas por esmagamento embrionário e lavagem prévias à dissecção. Para preservar o RPE intacto, o levantamento cuidadoso desse tecido separa eficientemente a coroide e a esclera da retina com RPE aderido, seguido pela remoção do cristalino utilizando uma agulha de tungstênio quimicamente gravada. Este método de dissecção permite obter tecidos retinianos intactos e tem sido utilizado com sucesso para estudar a expressão específica de RNA e os perfis do tecido da retina e do epitélio pigmentar retiniano de peixe-zebra.Olá, sou Li Jang do laboratório do Professor UFE Leon do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Purdue. Hoje vamos mostrar como dissecar tecidos oculares embrionários de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a rede gênica que regula o desenvolvimento ocular.Então vamos começar. Oito. Antes da microdissecção, prepare as seguintes soluções: solução de Ringer E3, meio filtrado e esterilizado, e hidróxido de sódio a cinco por cento.Em seguida, ataque quimicamente agulhas de tungstênio. Coloque um béquer pequeno em um recipiente de Petri usando argila para facilitar o manuseio do béquer e evitar derramamento de hidróxido de sódio. Prenda um clipe de papel comum à lateral do béquer.Despeje cinco hidróxidos de sódio normais no béquer até que o clipe entre em contato com o hidróxido de sódio. Conecte o eletrodo negativo de uma fonte de alimentação CC ao clipe e o eletrodo positivo a uma extremidade de um pequeno pedaço de fio de tungstênio. Envolva a outra extremidade do fio de tungstênio com uma bola de argila de quatro milímetros de diâmetro e mergulhe essa extremidade na solução de hidróxido de sódio.Aumente a voltagem para aproximadamente três volts e mergulhe o fio para cima e para baixo, em intervalos de um segundo, na solução de hidróxido de sódio por cerca de 10 minutos. O fio de tungstênio exposto ao hidróxido de sódio ficará gradualmente mais fino, e quando a bolinha de argila cair do outro lado do fio ligado ao eletrodo positivo, terá a forma de uma agulha fina. Enxágue a agulha fina com solução de Ringer ou E três para remover depósitos de sal e fixe a agulha a um aplicador de madeira com fita adesiva ou um suporte para agulhas para facilitar o manuseio ao preparar embriões para dissecação.Mantenha peixes adultos superiores de acordo com protocolos padrão na noite anterior ao acasalamento. Separe os peixes reprodutores em tanques de reprodução estáticos aos pares, utilizando um divisor. Remova o divisor após a luz do ambiente ser ligada na manhã seguinte e permita que os reprodutores acasalem em intervalos de 10 minutos a cada meia hora, separando os peixes após cada acasalamento.Mantenha os embriões coletados de cada cruzamento em meio E3 separadamente a 28 graus Celsius. Estagie os embriões entre 10 e 12 horas após a fertilização e reestagie imediatamente antes da dissecação nos pontos de tempo específicos. Utilize placas de cultura de poliestireno Falcon de 60 por 15 milímetros para a dissecação.Uma placa nova e não utilizada possui uma propriedade adesiva intrínseca para o tecido do epitélio pigmentado da retina (RPE) por até aproximadamente 20 minutos e pode auxiliar na remoção do RPE para dissecações retinianas. Se for desejado o retina com RPE aderido, essa propriedade adesiva pode ser superada esmagando completamente dois embriões em uma placa de cultura contendo solução de Ringer e deixando por 30 minutos antes da dissecação, seguido de lavagens extensivas com solução de Ringer fresca antes da dissecação. Todas as dissecações finas são realizadas com aumento de aproximadamente cinco a oito vezes em um microscópio Olympus SC X 16 com objetiva de uma vez.Usando pin&ccedil;as de Dumont ou uma agulha de tungst&ecirc;nio gravada quimicamente, aque&ccedil;a a platina do microsc&oacute;pio a 28 graus Celsius. Para minimizar a influ&ecirc;ncia da flutua&ccedil;&atilde;o de temperatura ao iniciar a dissec&ccedil;&atilde;o retiniana, transfira um embri&atilde;o em um est&aacute;gio de desenvolvimento espec&iacute;fico para cinco mililitros de solu&ccedil;&atilde;o de Ringer em uma placa de cultura Falcon de 60 por 15 mil&iacute;metros preparada conforme descrito para dissec&ccedil;&atilde;o retiniana sem EPRR, corte a cabe&ccedil;a e parte do tronco anterior usando a ponta afiada da pin&ccedil;a, removendo rapidamente o corpo do peixe-zebra. Em seguida, fixe a extremidade posterior da se&ccedil;&atilde;o do tronco da cabe&ccedil;a em uma placa de cultura. Com a pin&ccedil;a auxiliar, abra a cabe&ccedil;a no lado dorsal, come&ccedil;ando pela testa anterior.Remova o cérebro de modo que o lado medial dos olhos fique exposto e voltado para cima, para manipulações posteriores. Para dissecar a retina, use a extremidade da pinça para escovar cuidadosamente a EPR exposta no lado medial do olho voltado para cima, até que uma pequena abertura para a retina seja visível. Continue o movimento de escovação e desprendimento até que quase todo o lado medial da retina esteja exposto.Evite arranhar e perfurar a retina exposta durante a remoção do EPR lateral na retina do olho voltado para a abordagem da placa de cultura. Mantenha um ângulo de aproximadamente 45 graus em relação à superfície da placa de cultura e escove o olho com a pinça. Remova o EPR que está aderido de forma relativamente firme à ora serrata fixando a porção destacada do EPR na placa de cultura para a dissecação.Em seguida, levante suavemente a retina para limpar o EPR residual e remova a lente utilizando a propriedade adesiva da placa de cultura para fixação. Tenha cuidado para não danificar as células retinianas, que também aderem levemente à superfície da placa. Se a lente não se soltar com o movimento de rolamento, use uma agulha de tungstênio gravada com um movimento circular na superfície da lente.Para iniciar a dissecação da retina com epitélio pigmentado da retina (RPE) aderido, utilize uma placa de cultura Falcon de 60 por 15 milímetros preparada conforme descrito para uma dissecação de retina com RPE aderido. Transfira um embrião em um estágio de desenvolvimento específico para cinco mililitros de solução de Ringer. Corte a cabeça e parte do tronco anterior.Removendo rapidamente o corpo do peixe-zebra conforme feito anteriormente. Fixe a extremidade posterior da seção da cabeça e tronco em uma placa de cultura. Com a pinça auxiliar, abra a cabeça no lado dorsal, começando pela testa anterior.Remova o cérebro de modo que o lado medial dos olhos fique exposto e voltado para cima. Para manipulações adicionais usando pinça, levante suavemente o olho pelo lado lateral posterior e role-o para o lado anterior. A coroide e o tecido escleral na parte externa da camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) estão relativamente firmemente aderidos à pele e podem ser removidos em sua maior parte ao rolar cuidadosamente o olho para o lado anterior.Remova a lente com a agulha de tungstênio após a exposição da face lateral do olho e enquanto o olho ainda estiver ligado à pele para a dissecação da retina. Sem o EPR e com a retina com EPR anexado, as amostras dissecadas podem ser coletadas em triol em um tubo micro de RNA para etapas subsequentes. Caracterização de RNA.Uma dissecação retiniana bem-sucedida sem EPR é mostrada aqui, onde a integridade da retina é mantida, conforme indicado pela superfície retiniana intacta. A seção histológica correspondente também mostra que a arquitetura retiniana é muito bem preservada. Em particular, a preservação da matriz extracelular entre a camada de fotorreceptores e o EPR é excepcionalmente boa.Uma dissecção bem-sucedida da retina com camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) aderida é indicada por uma camada de RPE intacta e contínua. A seção histológica correspondente mostra que tanto as células da retina quanto as do RPE estão em boas condições. O RNA total extraído das retinas dissecadas é de alta qualidade.Isso é indicado pelo eletroferograma e pela imagem do gel obtidos pela análise no bioanalisador. A linha de base é plana e os picos ribossomais de 18 s e 28 s estão intactos. O número de integridade do RNA é tipicamente maior que 9,8.Acabamos de mostrar os procedimentos de microdissecção para obter a retina de embriões de peixe-zebra com e sem EPR. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as etapas mais críticas na dissecção da retina são a ação de escovar com a ponta das pinças e o rolamento do tecido. Para a remoção de remanescentes de EPR, descobrimos que apoiar os cotovelos nos descansos de braço ajustáveis da cadeira durante a dissecação pode estabilizar substancialmente os movimentos das mãos.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Lente de desenvolvimento envolve interações com outros tecidos. Mutantes olho várias zebrafish são caracterizados por um tamanho de lente anormalmente pequena. Aqui demonstramos um experimento de transplante de lente para determinar se este fenótipo é devido a causas intrínsecas ou interações com defeito com os tecidos que circundam a lente.

Transplante de lente em Zebrafish e sua Aplicação na Análise de Mutantes Eye

Este vídeo descreve o protocolo desenvolvido para dissecar lentes de peixe-zebra adultas e larvais para analisar a morfologia cortical da lente e a integridade estrutural das suturas da lente.

Dissecção da lente do olho: uma técnica para observar a morfologia da lente do peixe-zebra

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

A microscopia de fluorescência de folha de luz é uma excelente ferramenta para imagens do desenvolvimento embrionário. Permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas. Demonstramos sua aplicação para o desenvolvimento de imagens do olho do peixe-zebra em amplas escalas espaço-temporais e apresentamos um pipeline para fusão e deconvolução de conjuntos de dados multiview.

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Este protocolo descreve as etapas necessárias para obter resultados de localização Subcellular da proteína na retina de zebrafish, correlacionando a microscopia de luz super resolução e imagens de microscopia eletrônica de varredura.

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

Aqui, vamos discutir um protocolo do método que permite uma análise fácil da vasculatura da retina tg(fli:EGFP) adulto zebrafish como uma leitura rápida em configurações de longo prazo patologias vasculares relacionadas a neoangiogênese e mudanças estruturais.

Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o sulco superior e ocular, uma estrutura recentemente identificada, conservado evolutivamente no olho vertebrado. Usando zebrafish larvas, demonstraremos técnicas necessárias para identificar os fatores que contribuem para a formação e o fechamento do sulco superior ocular.

Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Aqui, é fornecido um protocolo para imagens de lapso de tempo de morfogênese ocular usando um microscópio de folha de luz comercialmente disponível e uma estação de trabalho de processamento de imagem para analisar os dados resultantes. Este protocolo detalha os procedimentos para anestesia embrionária, incorporando em baixa temperatura de fusão agarose, suspensão na câmara de imagem, configuração dos parâmetros de imagem e, finalmente, analisando os dados de imagem usando software de análise...

Visualizando Morfogênese Ocular por Microscopia de Folha de Luz usando rx3:GFP Zebrafish Transgênico

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Aprenda a microdissecção de retina e epitélio pigmentar da retina em embriões de zebrafish de um a três dias pós-fertilização. Este método preserva tecidos intactos para estudos de expressão de RNA.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

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