Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Este vídeo mostra a microdissecação da retina e da retina com pigmento retiniano, epitélio pigmentado da retina, ou RPE, anexado de embriões de peixe-zebra com um a três dias pós-fertilização. Todos os procedimentos podem ser realizados com pinças finas e materiais de laboratório comuns. Sob microscópios estereoscópicos padrão para dissecação retiniana, a camada única de RPE é removida e destacada por meio de uma ação de escovação e da aderência do RPE à superfície da placa de cultura.

Para a dissecção da retina com epitélio pigmentar retiniano (RPE) aderido, as propriedades adesivas da placa de cultura são removidas por esmagamento embrionário e lavagem prévias à dissecção. Para preservar o RPE intacto, o levantamento cuidadoso desse tecido separa eficientemente a coroide e a esclera da retina com RPE aderido, seguido pela remoção do cristalino utilizando uma agulha de tungstênio quimicamente gravada. Este método de dissecção permite obter tecidos retinianos intactos e tem sido utilizado com sucesso para estudar a expressão específica de RNA e os perfis do tecido da retina e do epitélio pigmentar retiniano de peixe-zebra.

Olá, sou Li Jang do laboratório do Professor UFE Leon do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Purdue. Hoje vamos mostrar como dissecar tecidos oculares embrionários de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a rede gênica que regula o desenvolvimento ocular.

Então vamos começar. Oito. Antes da microdissecção, prepare as seguintes soluções: solução de Ringer E3, meio filtrado e esterilizado, e hidróxido de sódio a cinco por cento.

Em seguida, ataque quimicamente agulhas de tungstênio. Coloque um béquer pequeno em um recipiente de Petri usando argila para facilitar o manuseio do béquer e evitar derramamento de hidróxido de sódio. Prenda um clipe de papel comum à lateral do béquer.

Despeje cinco hidróxidos de sódio normais no béquer até que o clipe entre em contato com o hidróxido de sódio. Conecte o eletrodo negativo de uma fonte de alimentação CC ao clipe e o eletrodo positivo a uma extremidade de um pequeno pedaço de fio de tungstênio. Envolva a outra extremidade do fio de tungstênio com uma bola de argila de quatro milímetros de diâmetro e mergulhe essa extremidade na solução de hidróxido de sódio.

Aumente a voltagem para aproximadamente três volts e mergulhe o fio para cima e para baixo, em intervalos de um segundo, na solução de hidróxido de sódio por cerca de 10 minutos. O fio de tungstênio exposto ao hidróxido de sódio ficará gradualmente mais fino, e quando a bolinha de argila cair do outro lado do fio ligado ao eletrodo positivo, terá a forma de uma agulha fina. Enxágue a agulha fina com solução de Ringer ou E três para remover depósitos de sal e fixe a agulha a um aplicador de madeira com fita adesiva ou um suporte para agulhas para facilitar o manuseio ao preparar embriões para dissecação.

Mantenha peixes adultos superiores de acordo com protocolos padrão na noite anterior ao acasalamento. Separe os peixes reprodutores em tanques de reprodução estáticos aos pares, utilizando um divisor. Remova o divisor após a luz do ambiente ser ligada na manhã seguinte e permita que os reprodutores acasalem em intervalos de 10 minutos a cada meia hora, separando os peixes após cada acasalamento.

Mantenha os embriões coletados de cada cruzamento em meio E3 separadamente a 28 graus Celsius. Estagie os embriões entre 10 e 12 horas após a fertilização e reestagie imediatamente antes da dissecação nos pontos de tempo específicos. Utilize placas de cultura de poliestireno Falcon de 60 por 15 milímetros para a dissecação.

Uma placa nova e não utilizada possui uma propriedade adesiva intrínseca para o tecido do epitélio pigmentado da retina (RPE) por até aproximadamente 20 minutos e pode auxiliar na remoção do RPE para dissecações retinianas. Se for desejado o retina com RPE aderido, essa propriedade adesiva pode ser superada esmagando completamente dois embriões em uma placa de cultura contendo solução de Ringer e deixando por 30 minutos antes da dissecação, seguido de lavagens extensivas com solução de Ringer fresca antes da dissecação. Todas as dissecações finas são realizadas com aumento de aproximadamente cinco a oito vezes em um microscópio Olympus SC X 16 com objetiva de uma vez.

Usando pinças de Dumont ou uma agulha de tungstênio gravada quimicamente, aqueça a platina do microscópio a 28 graus Celsius. Para minimizar a influência da flutuação de temperatura ao iniciar a dissecção retiniana, transfira um embrião em um estágio de desenvolvimento específico para cinco mililitros de solução de Ringer em uma placa de cultura Falcon de 60 por 15 milímetros preparada conforme descrito para dissecção retiniana sem EPRR, corte a cabeça e parte do tronco anterior usando a ponta afiada da pinça, removendo rapidamente o corpo do peixe-zebra. Em seguida, fixe a extremidade posterior da seção do tronco da cabeça em uma placa de cultura. Com a pinça auxiliar, abra a cabeça no lado dorsal, começando pela testa anterior.

Remova o cérebro de modo que o lado medial dos olhos fique exposto e voltado para cima, para manipulações posteriores. Para dissecar a retina, use a extremidade da pinça para escovar cuidadosamente a EPR exposta no lado medial do olho voltado para cima, até que uma pequena abertura para a retina seja visível. Continue o movimento de escovação e desprendimento até que quase todo o lado medial da retina esteja exposto.

Evite arranhar e perfurar a retina exposta durante a remoção do EPR lateral na retina do olho voltado para a abordagem da placa de cultura. Mantenha um ângulo de aproximadamente 45 graus em relação à superfície da placa de cultura e escove o olho com a pinça. Remova o EPR que está aderido de forma relativamente firme à ora serrata fixando a porção destacada do EPR na placa de cultura para a dissecação.

Em seguida, levante suavemente a retina para limpar o EPR residual e remova a lente utilizando a propriedade adesiva da placa de cultura para fixação. Tenha cuidado para não danificar as células retinianas, que também aderem levemente à superfície da placa. Se a lente não se soltar com o movimento de rolamento, use uma agulha de tungstênio gravada com um movimento circular na superfície da lente.

Para iniciar a dissecação da retina com epitélio pigmentado da retina (RPE) aderido, utilize uma placa de cultura Falcon de 60 por 15 milímetros preparada conforme descrito para uma dissecação de retina com RPE aderido. Transfira um embrião em um estágio de desenvolvimento específico para cinco mililitros de solução de Ringer. Corte a cabeça e parte do tronco anterior.

Removendo rapidamente o corpo do peixe-zebra conforme feito anteriormente. Fixe a extremidade posterior da seção da cabeça e tronco em uma placa de cultura. Com a pinça auxiliar, abra a cabeça no lado dorsal, começando pela testa anterior.

Remova o cérebro de modo que o lado medial dos olhos fique exposto e voltado para cima. Para manipulações adicionais usando pinça, levante suavemente o olho pelo lado lateral posterior e role-o para o lado anterior. A coroide e o tecido escleral na parte externa da camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) estão relativamente firmemente aderidos à pele e podem ser removidos em sua maior parte ao rolar cuidadosamente o olho para o lado anterior.

Remova a lente com a agulha de tungstênio após a exposição da face lateral do olho e enquanto o olho ainda estiver ligado à pele para a dissecação da retina. Sem o EPR e com a retina com EPR anexado, as amostras dissecadas podem ser coletadas em triol em um tubo micro de RNA para etapas subsequentes. Caracterização de RNA.

Uma dissecação retiniana bem-sucedida sem EPR é mostrada aqui, onde a integridade da retina é mantida, conforme indicado pela superfície retiniana intacta. A seção histológica correspondente também mostra que a arquitetura retiniana é muito bem preservada. Em particular, a preservação da matriz extracelular entre a camada de fotorreceptores e o EPR é excepcionalmente boa.

Uma dissecção bem-sucedida da retina com camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) aderida é indicada por uma camada de RPE intacta e contínua. A seção histológica correspondente mostra que tanto as células da retina quanto as do RPE estão em boas condições. O RNA total extraído das retinas dissecadas é de alta qualidade.

Isso é indicado pelo eletroferograma e pela imagem do gel obtidos pela análise no bioanalisador. A linha de base é plana e os picos ribossomais de 18 s e 28 s estão intactos. O número de integridade do RNA é tipicamente maior que 9,8.

Acabamos de mostrar os procedimentos de microdissecção para obter a retina de embriões de peixe-zebra com e sem EPR. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as etapas mais críticas na dissecção da retina são a ação de escovar com a ponta das pinças e o rolamento do tecido. Para a remoção de remanescentes de EPR, descobrimos que apoiar os cotovelos nos descansos de braço ajustáveis da cadeira durante a dissecação pode estabilizar substancialmente os movimentos das mãos.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.