Enxertia de ilhotas pancreáticas: um método para implantar ilhotas pancreáticas na câmara anterior do olho do camundongo para imagens in vivo

- As ilhotas pancreáticas contêm células beta que secretam insulina. Em pacientes com diabetes tipo 1, as células beta produtoras de insulina tornam-se disfuncionais. O transplante de ilhotas nesses pacientes oferece potencial para fornecer controle glicêmico. Para avaliar a eficiência do transplante, usamos modelos animais, como um camundongo cuja câmara ocular anterior é um local ideal para enxerto e imagem in vivo.

Para transplantar ilhotas, coloque um camundongo anestesiado em uma almofada de aquecimento quente e injete buprenorfina, um analgésico para aliviar a dor, por via subcutânea na parte de trás do camundongo. Em seguida, insira o nariz do mouse em uma máscara nasal para um suprimento contínuo de oxigênio e isoflurano anestésico.

Fixe a cabeça do mouse no suporte de cabeça para expor o olho e retraia suavemente a pálpebra usando uma pinça romba para tirar o olho. Carregue uma cânula com ilhotas marcadas com fluorescência. Insira a meia ponta da cânula na córnea. Levante a córnea, dispense suavemente as ilhotas, remova a cânula e aplique gel para os olhos.

Após a duração desejada, coloque o mouse sob um microscópio de dois fótons e tire as imagens. Você pode observar vasos sanguíneos formando uma rede microvascular em todo o enxerto. No protocolo a seguir, realizaremos o enxerto de ilhotas pancreáticas humanas na câmara ocular anterior do camundongo.

Para começar, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento quente, posicione-o no suporte da cabeça e coloque a máscara nasal. Use o polegar e o indicador para levantar ligeiramente a cabeça. Prenda-o com as peças metálicas nas laterais, certificando-se de que os fones de ouvido fixem a cabeça diretamente abaixo das orelhas. Por via subcutânea, injete a solução de buprenorfina na parte de trás do camundongo. Delicadamente, retraia as pálpebras do olho a ser transplantado usando uma pinça romba. Retire o olho e fixe-o frouxamente com uma pinça coberta com um tubo de polietileno.

Depois de transferir as ilhotas para uma placa de Petri com PBS, pegue aproximadamente 20 a 30 ilhotas na cânula do olho. Usando uma agulha de calibre 25, incline para cima, insira cuidadosamente a ponta na córnea e faça uma única incisão lateral. Levante cuidadosamente a córnea com a cânula pré-carregada com ilhotas e solte lentamente as ilhotas no olho. Retraia lentamente a cânula e aplique gel ocular no olho.

Após 10 minutos, remova a pinça que segura a pálpebra e coloque o olho de volta à sua posição normal. Para imagens de ilhotas humanas implantadas com microscopia de dois fótons, coloque a plataforma de suporte da cabeça sob o microscópio e administre gel ocular no olho como um líquido de imersão entre a córnea e a lente. Posicione o olho sob a objetiva e imagine as ilhotas humanas implantadas conforme descrito no manuscrito do texto.