JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
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- Organoides são pequenas culturas de células tridimensionais derivadas de células-tronco específicas de tecidos. Eles são genomicamente estáveis, mas geneticamente modificáveis por meio de transfecção e, portanto, ideais para investigação genética. Para a transfecção, semeie organoides em uma placa de cultura multipoços com um meio de cultura específico e incube pela duração desejada. Em seguida, adicione uma mistura de dissociação à placa para ajudar na dissociação das células organoides. Transfira a mistura para um tubo e centrifugue. Ressuspenda o pellet organoide em um tampão de eletroporação contendo DNA de plasmídeo marcado com fluorescência. O tampão estabiliza as células e evita a morte celular devido ao estresse elétrico.
Transfira a mistura para uma cubeta e eletropore as células. Impulsos elétricos através da membrana celular resultam na formação temporária de poros para facilitar a absorção do DNA do plasmídeo na célula. Após a eletroporação, adicione imediatamente o meio de cultura à suspensão celular e transfira a mistura para um tubo. Agora, centrifugue as células. Ressuspenda o pellet na matriz do embasamento e transfira para a placa multipoços para polimerização. Coloque a placa sob um microscópio fluorescente e verifique se há fluorescência nas células, o que confirma a transfecção eficiente. No protocolo a seguir, realizaremos eletroporação para transfectar organoides gastrointestinais.
- Comece pré-aquecendo placas de 48 poços a 37 graus Celsius para semeadura pós-eletroporação e, em seguida, prepare os meios específicos da cultura basal e organoide de acordo com as instruções do manuscrito. Cultive cinco poços de organoides por amostra de eletroporação em uma placa de 48 poços. Prepare 230 microlitros de reagente de dissociação com 10 micromolares Y27632 por poço. Monitore os organoides sob um microscópio. Remover o meio de cultura dos alvéolos e dissociar mecanicamente os organoides na mistura de dissociação preparada. Agrupe cinco poços por amostra de eletroporação em um tubo de 15 mililitros.
Misture o conteúdo do tubo por vórtice e incube-o por 5 a 15 minutos a 37 graus Celsius até que ocorram aglomerados de 10 a 15 células, verificando a dissociação com o microscópio. Pare a digestão adicionando até 10 mililitros de meio basal sem antibióticos. Centrifugar o tubo a 450 vezes g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e lave as células duas vezes com 4 mililitros de tampão de eletroporação. Centrifugue e descarte o sobrenadante após cada lavagem. Após as lavagens, ressuspenda o pellet organoide em 100 microlitros de tampão de eletroporação com 30 microgramas de DNA plasmidial.
Dispense a mistura completa de DNA-organoide em uma cubeta de eletroporação. Certifique-se de evitar bolhas de ar. Defina os parâmetros de eletroporação conforme descrito no manuscrito do texto e bata na cubeta com um dedo para misturar suavemente as células. Coloque a cubeta na câmara da cubeta e pressione o botão de impedância no eletroporador para anotar o valor da impedância. Pressione o botão Iniciar para iniciar o programa de eletroporação e controlar os valores das correntes, voltages e energias exibidas.
Após a eletroporação, adicione imediatamente 500 microlitros de meio de cultura sem antibióticos às células e misture pipetando para cima e para baixo. Transfira a amostra para um novo tubo de 15 mililitros e lave a cubeta com meio basal para coletar as células restantes, depois incube as células em temperatura ambiente por 40 minutos. Centrifugar as células a 450 vezes g durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de matriz basal e semeie gotas de 20 microlitros em uma placa pré-aquecida de 48 poços.
Incube a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius para polimerização e adicione 250 microlitros de meio de cultura suplementado com Y27632 e CHIR-99021 por poço. Para determinar a eficiência da transfecção, verifique a fluorescência no controle de transfecção ao microscópio após 24 a 48 horas.