Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 5:00 min. • April 30th, 2023
- As células T ativadas se movem para o microambiente tumoral pancreático, onde liberam citocinas como interferon-gama, ou IFN gama, e fator de necrose tumoral alfa, ou TNF alfa, que ajuda a mediar uma resposta antitumoral eficaz. À medida que as citocinas saem rapidamente da célula T, os níveis intracelulares podem ser indetectáveis. Portanto, a célula T requer estimulação para aumentar a produção basal de citocinas para estudar seu papel terapêutico no tumor.
Comece tomando uma suspensão de células tumorais do pâncreas do camundongo. Agora, trate as células T presentes na suspensão celular com um coquetel de estimulação de citocinas e incube a mistura pelo tempo desejado. Este coquetel facilita a liberação de íons de cálcio do retículo endoplasmático para o citoplasma. Altos níveis de cálcio, por sua vez, ativam certos fatores de transcrição nuclear, levando a um aumento na produção de citocinas nas células T.
Em seguida, trate as células com um coquetel inibidor de transporte de proteínas e incube o tubo. Este coquetel bloqueia o transporte de citocinas do retículo endoplasmático para o complexo de golgi, resultando no acúmulo de citocinas dentro da célula. Finalmente, core as células usando marcadores intracelulares apropriados para análise de citometria de fluxo. No protocolo a seguir, realizaremos estimulação de células T para aumentar a concentração intracelular de citocinas.
- Para começar, use uma pinça para transferir o tumor para uma placa de Petri. Armazene 5 mililitros de meio de digestão em um tubo de 50 mililitros no gelo para evitar o início da atividade enzimática. Pegue uma pequena alíquota desta solução para cobrir o tumor na placa de Petri. Use um bisturi estéril e uma pinça para cortar o tumor em pedaços pequenos, com menos de 3 milímetros de comprimento. Raspe os pedaços do tumor no tubo e inverta suavemente o tubo até que todos os pedaços estejam submersos no meio de digestão. Transfira o tubo para um dispositivo de agitação por 20 minutos a 37 graus Celsius para digerir. Certifique-se de que todos os pedaços do tumor estejam submersos e não presos à borda do tubo.
Imediatamente após a etapa de digestão, coloque o tubo no gelo para diminuir a atividade enzimática. Adicione EDTA para atingir uma concentração final de 20 milimolares e faça um vórtice breve da amostra para misturar a fim de retardar ainda mais a atividade enzimática. Abra o tubo e enxágue qualquer digestão do tumor da tampa do tubo com meio RPMI fresco. Em seguida, prepare uma peneira de 70 mícrons. Coloque-o em um tubo aberto de 50 mililitros no gelo. Molhe previamente o filtro com meio. Ressuspenda as células digeridas e lave as laterais do tubo usando uma faixa de 25 mililitros ou maior. A abertura mais larga da faixa permite que o digestor espesso passe facilmente.
Transfira todo o digesto para a peneira usando a tira de 25 mililitros. Amasse para cima e para baixo o tumor em cima do filtro usando um êmbolo de seringa de 1 mililitro. Lave continuamente as células através do filtro com RPMI. Certifique-se de lavar com força suficiente para empurrar as células. Continue lavando até que todas as células tenham passado pelo filtro. Centrifugue o tubo durante cinco minutos a 300 vezes g e 4 graus Celsius.
Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular e complete o RPMI e passe diretamente por outro filtro para remover qualquer matriz extracelular ou aglomerados de células grandes que não possam ser ressuspensos adequadamente. Se nenhuma estimulação for necessária, cove imediatamente as células isoladas para análise de citometria de fluxo ou ressuspenda-as em meio de congelamento de 10% de DMSO em FBS e armazene a 80 graus Celsius negativos.
Para realizar a estimulação, primeiro conte as células. Diluir as células em meio completo para atingir uma concentração de 2 vezes 10 elevado a 6 por 100 microlitros. Colocar 100 microlitros de células em cada alvéolo de uma placa de 96 poços com fundo em U. Adicione 100 microlitros de meio completo contendo uma preparação 2X de PMA e ionomicina. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, adicione 20 microlitros de uma preparação 10X de Brefeldin-A e Monensina e meio completo para atingir uma concentração final de 1,06 micromolar e 2,0 micromolar, respectivamente. Coloque a placa de volta na incubadora por mais quatro horas.