Dinâmica do cálcio de imagem em células pancreáticas: uma técnica para estudar mudanças em tempo real na concentração citosólica de cálcio em ilhotas pancreáticas

- As ilhotas pancreáticas são um aglomerado de células pancreáticas produtoras de hormônios que desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase da glicose. A concentração elevada de glicose desencadeia o fechamento dos canais de íons de potássio, impedindo o efluxo de íons de potássio, levando à despolarização da membrana. Em consequência, os canais de íons de cálcio dependentes de voltagem se abrem, permitindo o influxo de íons de cálcio. Esse aumento da concentração citosólica de cálcio estimula a liberação de hormônios como a insulina. Em tempo real, para obter imagens da dinâmica do cálcio citosólico, transfira algumas ilhotas carregadas com corante indicador de cálcio adequado entre as paredes espaçadoras de uma malha fina pré-montada.

Posicione a malha de cabeça para baixo em uma lamínula colocada dentro da câmara de imagem de um microscópio invertido. Coloque uma malha grossa e peso para imobilizar as células. Adicione a solução de imagem na câmara. Em seguida, configure um sistema de perfusão para introduzir glicose ou um hormônio de teste de interesse. Dentro das células, indicadores fluorescentes de cálcio pré-carregados relatam qualquer aumento nas concentrações citosólicas de cálcio. Ao se ligarem aos íons de cálcio, as moléculas indicadoras exibem um aumento substancial na emissão de fluorescência. No protocolo a seguir, mostraremos a imagem em tempo real da dinâmica do cálcio em ilhotas pancreáticas murinas em resposta à perfusão de glicose.

- Para imobilizar as ilhotas para imagens, monte uma câmara de imagem para um microscópio invertido e coloque uma lamínula de vidro dentro da câmara. Certifique-se de que a interface da câmara de vidro seja estanque e confirme se a lamínula está ao alcance da objetiva do microscópio. Em seguida, corte quadrados de 20 x 20 milímetros de malha fina e grossa e use pedaços de 45 a 50 micrômetros de fita adesiva grossa para criar duas paredes espaçadoras em um pedaço de malha fina. Mergulhe a malha grossa e um peso em uma placa de Petri de 35 milímetros de solução de imagem e coloque a malha fina sob um microscópio de dissecação.

Vire a malha fina com as paredes espaçadoras de cabeça para baixo e os espaçadores voltados para cima e use uma pipeta P20 para transferir várias ilhotas entre os dois espaçadores. Usando uma pinça de relojoeiro, coloque a malha de cabeça para baixo dentro da câmara de imagem do microscópio invertido de modo que os espaçadores fiquem voltados para baixo para ficarem diretamente na lamínula da câmara, prendendo as ilhotas entre os espaçadores e a malha no meio da lamínula.

- Tome cuidado para que a tela esteja bem hidratada sem conter volumes excessivos de solução, o que provocaria o movimento lateral da amostra.

- Em seguida, coloque a malha grossa e o peso em cima da malha fina na câmara e adicione a solução de imagem à câmara. Uma vez que as ilhotas tenham sido imobilizadas, selecione o modo de imagem e a objetiva no microscópio invertido e coloque a câmara com as ilhotas no estágio de temperatura controlada do microscópio. Depois de definir a perifusão, posicione o fluxo de entrada abaixo do fluxo de saída dentro da câmara e defina o fluxo de saída para ser maior que o fluxo de entrada.

Certifique-se de que o fluxo de saída tenha contato mínimo com a solução para que ele remova a solução em várias pequenas gotículas sequenciais de espera por longos intervalos de remoção contínua da solução. Em seguida, inicie a perifusão com solução de imagem contendo glicose 3 milimolar e selecione o caminho da luz e os filtros para a imagem dos fluoróforos verdes. Em seguida, execute imagens ao vivo para configurar os parâmetros de imagem e ajuste a visualização para capturar as ilhotas de interesse.

Para otimizar a relação sinal-ruído da imagem, ajuste a intensidade da luz de excitação, o tempo de exposição e o binning, garantindo que as configurações permitam uma visualização distinta de cada célula dentro das ilhotas com a menor intensidade de luz e exposição possíveis. Em seguida, crie imagens das ilhotas em 0,1 a 5 Hertz, verificando a qualidade dos dados adquiridos à medida que são capturados.